杜 柏，胡元会，马铁民，刘瑞华，方素萍，吴华芹，褚瑜光，高 扬
能量代谢障碍贯穿于心肌从代偿性肥大到衰竭的全过程，是心力衰竭（心衰）发生、发展和恶化的重要因素之一［1］。研究改善能量代谢的措施，对于防治心衰的发生发展具有重要意义。心复康口服液是临床治疗气虚血瘀型充血性心力衰竭的经验方。临床和实验研究提示［2－4］，心复康口服液可改善心肌缺血，提高心功能。本实验通过研究心复康口服液对心肌梗死后心衰大鼠心肌肌酸激酶能量穿梭中线粒体肌酸激酶（mitochondrialcreatine kinase，mit－CK）mRNA 及mit－CK 蛋白表达的影响，探讨心复康口服液对心力衰竭时心肌能量代谢转运穿梭的调节作用。
1 材料与方法
1.1 仪器 HX－300S动物呼吸机（成都泰盟科技有限公司），TA1003型精密电子天平（上海天平仪器厂），BL－820S生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司），HP5500 彩色多普勒超声显像仪（PHILIPS美国），YY0103－93冷光单孔手术灯（上海富众生物科技有限公司），Bio－Rad CFX96 实时荧光PCR 仪（Bio－Rad美国），DU 800 分光光度计（BECKMAN 美国），Bio－Rad电泳仪、multisKan酶标仪（Thermo美国）。
1.2 药物 心复康口服液（Xinfukan oral liquid，XFK）：由人参、黄芪、丹参、附子、淫羊藿、灵芝等药物组成，批号：北联制字2011FP04006。卡托普利（Captopril）：中美上海施贵宝制药有限公司，批号：1112035。
1.3 试 剂 TRIzol，M－MLV Reverse Transcriptase，RNase－OUTTM Ribonuclease Inhibitor（Invitrogen）；pMD18－T Vector、ExTaq 酶 （Takara）；Ampicillin（Sigma）；Super Real Pre Mix（SYBR Green）、DH5α感受态细胞、X－Gal、IPTG、质粒提取试剂盒（天根）；DEPC 水（碧云天）；DNA 纯化回收试剂盒（广州东盛）；引物均由Invitrogen公司合成。3 0%凝胶贮备液（Sigma）、SDS、1%TEMED（N，N，N’，N’－四甲基乙二胺）、过硫酸铵（均为Bio－Rad）、考马斯亮蓝R250（碧云天）、标准蛋白质溶 液（KANGLONG），一 抗：Mit－CK（SANTA CRUZ，sc－15169），GAPDH（sigma，g8795），二抗：羊抗（sigma，A5420）、兔抗（abcam）、鼠抗（abcam）。
1.4 实验动物 正常雄性SD 大鼠（清洁Ⅱ级），体重200g±20g，60只，由北京维通利华实验动物中心提供，许可证编号：SCXK（京）2007－0001，由中国中医科学院广安门医院Ⅱ级动物房分笼饲养，饲以标准的大鼠合成饲料，自由饮用自来水，环境温度20 ℃±2 ℃，相对湿度45%～70%。
1.5 动物模型复制 动物模型制备：参照Pfeffer报道［5］的方法结扎冠状动脉前降支，制备心肌梗死后心衰大鼠模型，术后每只大鼠肌肉注射青霉素钠1×105U／d，连续3d。假手术组制备：仅在LAD 起始点下2mm～3mm 处针带线从LAD 下穿过而不结扎前降支，余步骤与动物模型制备方法相同。
1.6 实验分组及给药方法 动物购回后分笼喂养，饲以大鼠标准合成颗粒饲料，保持充分的食物饮水、12h光照、充足通风，适应性喂养观察3d；禁食12h后，按体重均衡，随机分为假手术组（12只）和造模组（48只）。造模组大鼠按动物模型复制方法造模，造模成功大鼠复苏后24h，经超声检测心功能，以CO值减损15%为充血性心力衰竭（CHF）模型成功，列入造模组，然后再将造模成功大鼠随机分为模型组、卡托普利组、心复康组，每组12只大鼠，术后24h开始灌胃给药。各组大鼠于给药后6周末取材，进行指标检测。假手术组：生理盐水4.0mL／kg灌胃，每日1次；模型组：生理盐水4.0mL／kg灌胃，每日1次；卡托普利组：卡托普利100mg／kg溶于生理盐水中灌胃，每日1次；心复康组：心复康口服液按5.4g／kg剂量溶于生理盐水中灌胃，每日1次。
1.7 检测指标和方法
1.7.1 心肌组织mit－CKmRNA 表达的检测 灌胃给药6周末各组大鼠取心肌组织100 mg，保存于－86 ℃。用Real－time RT－PCR方法测定心肌组织mit－CKmRNA。①心肌组织总RNA 的提取：采用1mL TRIzol经氯仿、异丙醇提取总RNA。空气干燥5min～10min，加入DEPC 水20μL，吹吸混匀。分装，－20 ℃备用。取5μL RNA 溶液，10 倍稀释，测量A260、A280值，计算RNA 含量。②逆转录：Oligo dT，10pmol／μL 1 μL，dNTP 10mmol／L 4μL，RNA 2μg，DEPC水补至12μL；65℃5min，立即放于冰上5 min。在上水管中加入5×First－Strand Buffer 4μL，DTT 0.1 mol／μL 2μL，RNaseOUT.Ribonuclease Inhibitor 40unites／μL 1μL，MMLV 200unites／μL 1 μL。总 共RT 条件：37 ℃50 min，70 ℃15 min。③real－time PCR：引物为mit－CK，creatine kinase，mitochondrial 2，正向引物5′－CAG TGG CTA TAC CCT GGA CC－3′，反向引物5′－AGC CAC CAT GCC CAC AG－3′。实时PCR 条件：95 ℃，15min；95 ℃10s、60℃和62℃30s×40个循环；制备溶解曲线：65℃5s，0.5 ℃／s升温至95 ℃。④标准品制备：吸取2μL 质粒样本，50倍稀释，测量A260值，计算质粒拷贝数。分别稀释至1×1010copies／μL，再依次10倍稀释，制备成1×103copies／μL×108copies／μL系列浓度标准品。
1.7.2 检测样本Real－time RT－PCR绝对定量实验结果 样本RNA 逆转录（见实验步骤②逆转录）产物与标准品同时进行PCR 扩增（见实验步骤③real－time PCR）。
1.7.3 心肌组织mit－CK 蛋白表达的检测 灌胃：给药6周末各组大鼠取心肌组织100mg，保存于－86 ℃，用Western blotting方法测定心肌组织CK－MM 蛋白。将所取心肌组织研磨成匀浆，测定样品中蛋白浓度后，用SDS－聚丙烯酰胺缓冲液与蛋白样品混合，置于水浴锅中恒温变性。将变性处理过的蛋白样品加入浓缩胶中，每孔加蛋白20μg进行电泳，电压10mV。电泳结束后，将分离胶上的蛋白转移至PVDF 膜上。转膜条件：恒定电流100mA，NCX 和SERCA 转移2h。转膜结束后将膜放入封闭液中封闭。封闭结束后膜上蛋白依次与一抗、二抗结合，一抗结合过夜，二抗结合1h。二抗结合结束后，在膜上加ECL 化学发光底物，反应5min 后于暗室内将胶片置于转移膜上曝光，显影、定影后以凝胶成像系统分析结果。
2 结 果
2.1 XFK 对CHF 大 鼠 左 心 室 心 肌mit－CK mRNA 表 达 的 影响 第6周末，与假手术组比较，模型组左心室心肌mit－CK 的mRNA 表达水平下调（P＜0.01）；与模型组比较，卡托普利组、XFK 组左心室心肌mit－CK mRNA 表达上调（P＜0.01）；与卡托普利组比较，XFK 组左心室心肌CK－MMmRNA 表达水平下调（P＜0.05）。详见表1。心肌组织mit－CKmRNA Real－time PCR 结果见图1～图3。
图1 mit－CK mRNA 溶解曲线图
图2 mit－CK mRNA 扩增曲线图
图3 mit－CK mRNA 标准曲线图
2.2 XFK 对CHF大鼠左心室心肌mit－CK 蛋白表达的影 响第6周末，与假手术组比较，模型组左心室心肌mit－CK 的蛋白表达水平下调（P＜0.01）；与模型组比较，卡托普利组、XFK 组左心室心肌mit－CK 蛋白表达上调（P＜0.01）；与卡托普利组比较，XFK 组左心室心肌mit－CK 蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表1、图4。
表1 XFK 对CHF大鼠左心室心肌mit－CK mRNA、蛋白表达的影响
表1 XFK 对CHF大鼠左心室心肌mit－CK mRNA、蛋白表达的影响
与假手术组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01；与卡托普利组比较，3）P＜0.05
组别 mit－CKmRNA mit－CK 蛋白假手术组 19 796 405±9 143 375 0.98±0.13模型组 7 045 608±232 4521） 0.30±0.141）卡托普利组 18 819 620±5 908 1352） 0.67±0.192）XFK 组 17 231 797±6 037 2522）3） 0.68±0.182）
图4 XFK 对CHF大鼠左心室心肌mit－CK 蛋白表达的影响
3 讨 论
肌酸激酶能量穿梭系统是维持心肌能量代谢平衡的重要组成部分，其功能主要是将能量转运至肌原纤维并促使能量在肌原纤维中被消耗，从而确保心肌兴奋－收缩耦联的能量供应。该能量穿梭过程可简要描述为：在mit－CK 的催化下，三磷酸腺苷（ATP）中的高能磷酸键被转运至肌酸（Cr）中，形成磷酸肌酸（PCr）和二磷酸腺苷（ADP）。PCr是比ATP 小的分子，很快由线粒体弥散入肌原纤维，肌原纤维CK 催化PCr重新形成ATP。从PCr中去除磷酸后形成的游离Cr，通过弥散方式回到线粒体。上述CK 催化的能量反应过程被称为“肌酸激酶能量穿梭系统”［6］。已有报道显示，CHF 时肌酸激酶穿梭系统功能明显受损，CK 活性显着受抑，其中主要受抑的CK 是CK－MM和mit－CK。在CHF心肌组织中，mit－CK 的活性可下降至正常值的30%～40%，同时CK－MMmRNA 和mit－CKmRNA表达下调，CK－MM 和mit－CK 蛋白含量减少，导致ATP转运穿梭效率严重下降，细胞内能量流减少，其中转运至肌原纤维的能量最多可下降71%。此种能量穿梭功能异常造成心肌收缩功能障碍，尤其是导致心肌收缩功能储备减少，加剧了CHF 心功能的不断恶化［7，8］。
本研究结果提示，心肌梗死后心衰大鼠心脏由于缺血缺氧刺激，mit－CKmRNA 表达下调，mit－CK 蛋白含量减少与既往研究结果一致［8］。卡托普利组心肌梗死后心衰大鼠心肌细胞mit－CKmRNA 的表达进一步增加，调控肌酸激酶能量穿梭系统功能，从而导致ATP转运穿梭效率改善，细胞内能量流增加，直接促进心肌纤维的兴奋－收缩耦联过程，增强心肌收缩力。起到保护心衰心肌及心肌能量代谢的作用，达到保护心脏功能的目的。益气活血中药心复康口服液组可进一步上调心肌梗死后心衰大鼠心 肌 细 胞mit－CKmRNA 的 表 达，促 进mit－CK 蛋 白 含 量 增加。表明益气活血中药心复康口服液具有促进心肌梗死后心衰大鼠心肌mit－CKmRNA 的表达，增加mit－CK 蛋白含量，从而改善CHF时肌酸激酶穿梭系统的效率，进而影响心肌能量代谢过程，改善心衰引起的心肌能量代谢障碍及心肌功能损伤。
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