张蓓蓓，蔡 辉
Rho/ROCK信号通路与间质纤维化关系的研究进展
张蓓蓓，蔡 辉
间质纤维化是由细胞外基质(ECM)过度沉积引起的病理改变，是肝硬化、特发性肺纤维化、高血压、慢性肾炎、系统性硬化症等多种疾病致死的主要原因。纤维化组织的重要特征是肌成纤维细胞(MFB)的出现。Rho/ROCK信号通路介导的肌动蛋白骨架重组在MFB表型分化、收缩、迁移等行为中具有重要意义。阻断Rho/ROCK信号通路是治疗纤维化相关疾病的重要目标。本文综述了Rho/ROCK信号通路对MFB肌动蛋白骨架的调节，阐述了其在纤维化发生、发展中的作用。
间质纤维化；Rho；Rho激酶；肌成纤维细胞；肌动蛋白骨架
肌成纤维细胞(myofibroblast，MFB)是参与损伤修复和纤维化的主要细胞。Rho/Rho激酶(Rho-associated kinase，ROCK)信号通路介导的肌动蛋白骨架重组与MFB表型分化、收缩、迁移等行为关系密切。本文将对此进行综述，以期为治疗纤维化相关疾病提供新的思路。
1 Rho/ROCK信号通路
Rho/ROCK信号通路广泛参与生物体内细胞增殖、迁移、凋亡、基因表达等行为。
Rho包括RhoA、RhoB和RhoC三种异构体。Rho分子内GTP/ GDP结合域可以催化GTP水解，使Rho在活性型(GTP结合型)和失活型(GDP结合型)构象之间循环。Rho羧基端的共同结构域是翻译后修复的位点，其中包括异戊烯基转移酶底物半胱氨酸残基，只有经过修饰的Rho才具有活性。Rho上游信号因子包括：Eph受体(ephrin receptor)、髓鞘相关抑制分子(myelin-associated inhibitors)、溶血磷脂酸 (lysophosphatidic acid，LPA)、1-磷酸鞘氨醇(sphingosine -1- phosphate，S1P)、凝血酶(thrombin)[1]、血栓素A2(thromboxane A2)及其他细胞因子受体等。Rho下游信号因子包括ROCK、p140mDia、蛋白激酶N(protein kinase N，PKN)、Rho结合蛋白(Rhophilin)和 Rho靶蛋白(Rhotekin)等[2]。
ROCK是最早发现的Rho蛋白效应分子，属于丝氨酸/苏氨酸激酶，包括高度同源的ROCK1和ROCK2两个亚型。ROCK由N端的激酶结构域、中间包含Rho结合区域(RBD)的螺旋结构区及C末端富含半胱氨酸的PH结构域(CRD)构成。ROCK的底物包括肌球蛋白磷酸酶靶亚基1(myosin phosphatase-targeting subunit-1，MYPT1)、肌球蛋白轻链磷酸酶(myosin light chain phosphatase，MLCP)、LIM激酶(LIMK)、丝切蛋白(cofilin)、内收蛋白(adducin)、ERM家族成员埃兹蛋白(ezrin)/根蛋白(radixin)/膜突蛋白(moesin)及中等纤维(intermediate filaments)成分波形蛋白(vimentin)/结蛋白(desmin)等。MYPT1/肌球蛋白轻链(myosin light chain，MLC)[3]和LIMK/丝切蛋白是研究较为清楚的ROCK下游信号通路，与细胞内肌动蛋白骨架重组关系密切。
C3转移酶(C3 transferase) 因具有二磷酸腺苷(ADP)核糖基转移酶活性，可以催化Rho功能区域的ADP核糖基化，使Rho失活，阻断依赖Rho的信号转导通路。羟甲基戊二酰辅酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA)还原酶是Rho羧基端半胱氨酸残基异戊烯化修饰的关键酶，他汀类药物可以抑制此酶的活性，进一步抑制ROCK。Y-27632和法舒地尔是非选择性ROCK抑制剂，作用于三磷酸腺苷(ATP)结合区域，已广泛应用于研究。另外，还有一些ROCK抑制剂已经进入临床试验阶段，包括Y39983/RKI983、SAR407899、AR12286、K115、INS117548、DE104、BA210和AMA0076等[4]。
2 MFB与纤维化
MFB兼有成纤维细胞和平滑肌细胞的特征，是参与损伤修复和纤维化的主要细胞。在超微结构上，包含α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的应力纤维和超成熟黏着斑/纤维连接复合体是MFB最重要的特征。应力纤维是胞浆内纤维状肌动蛋白(F-肌动蛋白)和肌球蛋白组成的轴向束，是MFB主要的收缩结构。其中，F-肌动蛋白是由单体肌动蛋白即球状肌球蛋白(G-肌动蛋白)聚合而成。黏着斑为MFB特有的结构，主要由纽蛋白(vinculin)、张力蛋白(tensin)、桩蛋白(paxillin)、ED-A纤维连接蛋白(ED-A fibronectin)等黏着斑相关蛋白和整合素α、β亚基构成，参与MFB的力/化学信号传导。细胞内的微丝(肌动蛋白纤维)通过黏着斑和细胞外基质(ECM)中相关分子(如纤维连接蛋白)结合，将细胞锚定于基质中，并感应细胞外信号。MFB具有发达的粗面内质网和高尔基体，合成胶原的效率较成纤维细胞显着增加，还能自分泌转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α)、白细胞介素-6(interleukin-6)、单核细胞趋化因子-1(monocyte chemoattractant protein -1)、各种基质金属蛋白酶等。
机体受到炎症、氧化应激和缺血缺氧等刺激引起组织实质细胞坏死和ECM结构破坏时，多种来源的成纤维细胞活化，发生肌动蛋白骨架重组分化为MFB，加快组织修复。现在普遍认为，组织中固有成纤维细胞(resident fibroblasts)及临近周细胞(pericytes)、循环中骨髓来源的纤维细胞(fibrocytes)、上皮细胞和内皮细胞都可以分化为MFB[5]。多种细胞因子、生长因子和ECM成分可以改变肌动蛋白骨架，调节MFB分化，例如，TGF-β1、血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor)、黏着斑激酶(focal adhesion kinase)能促进MFB分化，碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor)、Smad7蛋白、脂质过氧化体增殖物激活受体-γ(peroxisome proliferator-activated receptor -γ)[6]则能抑制MFB分化。研究显示，MyoD[7]和前列腺素E2(prostaglandin E2)[8]诱导的成纤维细胞向MFB分化可以被逆转，说明MFB并非终末分化细胞。但MFB是通过凋亡，而不是去分化，消失于瘢痕组织中的[9]。
MFB凋亡是终止修复反应及恢复组织结构和功能的关键。皮肤的MFB在肉芽组织向成熟瘢痕进展过程中全部凋亡，可不遗留瘢痕，但梗死后的心脏瘢痕中MFB可持续存在，有的长达20年。MFB耐受凋亡是发生纤维化的重要原因。以MFB为靶目标的抗纤维化治疗包括：阻碍MFB形成和分化；促进MFB去分化；诱导MFB凋亡。
3 Rho/ROCK信号通路对 MFB的调节
成纤维细胞受到炎症、损伤等刺激后，ROCK接受Rho传递的活化信号后，发生丝氨酸/苏氨酸磷酸化而激活。活化的ROCK进一步磷酸化MLCP上的MLC结合亚单位，从而使MLCP活性下降，阻碍MLC脱磷酸化，提高成纤维细胞内MLC的磷酸化水平，增加肌球蛋白和肌动蛋白的交联，促使肌动蛋白聚合、重组。肌动蛋白骨架重组不仅是MFB分化的重要步骤，也是MFB收缩的重要动力。在损伤修复的早期，MFB收缩可阻止伤口扩大，后期则引起瘢痕挛缩。
抑制RhoA/ROCK信号通路是治疗纤维化相关疾病的有效方法[10]。Manickam等[11]研究发现，干扰RhoA表达和抑制ROCK可以显着降低TGF-β1诱导的肾MFB内Nox4蛋白、α-SMA的表达和NADPH氧化酶的活性，改善肾纤维化。Lee等[12]报道，雌二醇通过抑制RhoA/ROCK/丝切蛋白信号通路，改善卵巢切除大鼠心肌梗死后纤维化，但合用Y-27632并不能增加治疗效果。Porter等[13]发现，辛伐他汀能抑制RhoA和ROCK的活性，阻止培养的人心房肌成纤维细胞增殖，改善心室重构。Gu等[14]报道，ROCK抑制剂能阻止心脏瓣膜间质成纤维细胞(valvular interstitial cells， VICs)突起(node)形成和α-SMA表达，可能具有改善心脏瓣膜钙化的作用。Huang等[15]报道，F-肌动蛋白解聚剂松弛素可使RhoA/ROCK信号通路失活，肌球蛋白轻链磷酸化(MFB收缩性的标志)水平下降，对肺纤维化有治疗作用。
3.1 Rho/ROCK上游信号 以LPA和S1P为例。LPA和S1P同属溶血磷脂类分子，均能与细胞膜上的相应G蛋白耦联受体结合，激活包括Rho在内的下游信号分子，引起细胞基因表达、收缩、迁移等行为。
Tangkijvanich等[16]发现LPA诱导的肝MFB迁移具有剂量依赖性和饱和性，可以部分被Y-27632和SB-202190(一种p38MAPK抑制剂)所阻断，故溶血磷脂酸刺激的肝MFB迁移与Rho和p38MAPK有关。Parizi等[17]认为钙离子介导的MLCK活化，是LPA诱导的MFB收缩的必要条件，而非充分条件，单独的细胞内钙离子浓度升高不足以使MFB收缩。而MLCK抑制剂(KT5926和ML-7)、C3-转移酶、Y-27632可以抑制MFB收缩，说明LPA诱导的MFB收缩主要依赖于Rho/ROCK信号通路。Haak等[18]用LPA诱导的皮肤成纤维细胞作对照研究时发现，LPA活化Rho，能促进结缔组织生长因子、Ⅰ型胶原和α-SMA的表达。Gellings 等[19]报道S1P和鞘氨醇激酶-1(sphingosine kinase，SPHK1，S1P产生的关键酶)依赖S1P2受体和ROCK，以自分泌或旁分泌的方式，提高TGF-β诱导的心脏成纤维细胞α-SMA的表达和胶原合成，参与心肌纤维化。Kono等[20]发现，SPHK1刺激TGF-β1诱导的人和小鼠肺成纤维细胞向MFB分化也与ROCK有关。
3.2 Rho/ROCK下游信号 以心肌素相关性转录因子(myocardin related transcription factors，MRTFs)/血清反应因子(serum response factor，SRF)为例。MRTFs家族包括MRTF-A/MAL/ MKL1/BSAC 和MRTF-B/MKL2。MRTFs N端的RPEL区域与G-肌动蛋白的结合/解离状态决定MRTF的活性。静息状态下，G-肌动蛋白与内输蛋白α/β竞争性结合RPEL，阻止胞质MRTF的核转位。Rho活化后，细胞内G-肌动蛋白聚合成F-肌动蛋白，释放RPEL区域，MRTFs进入细胞核，当RPEL上的G-肌动蛋白全部被移除时，转录因子SRF被激活[18]。SRF在基因水平上调节α-SMA表达[18，21]。
Zhao等[22]建立了一个能提供稳定拉力的体外实验系统，用于观察组织预应力对成纤维细胞表达α-SMA的作用。在肌动蛋白微丝完整的前提下，施加最大压力10 min可诱导RhoA 活化，施压10 min～20 min后发生肌动蛋白微丝聚合。而转染MRTF-A负性调节因子、抑制ROCK或者促使肌动蛋白解聚可以完全阻断应力对α-SMA的表达。并认为应力介导的MFB分化与Rho/ ROCK/ LIMK/丝切蛋白途径有关。
Huang等[23]发现基质僵硬也可以活化RhoA/ROCK，诱导肌动蛋白骨架重构、MKL1核转位和MFB分化。纤维化组织中，MFB持续分泌ECM引起的ECM硬度增加是促使纤维化持续进展的重要因素。
Sandbo等[24]用TGF-β诱导肺成纤维细胞向MFB分化时发现，肌动蛋白聚合剂jasplakinolide能促进肺成纤维细胞MRTFs的核转位、SRF活化、应力纤维形成和α-SMA表达，而促肌动蛋白解聚剂Latrunculin B和Y-27632可以抑制以上过程。故推测，TGF-β诱导肺MFB分化包括3个步骤：①Smad依赖的中间信号分子介导Rho活化和应力纤维形成。②肌动蛋白聚合引起MKL1核转位和SRF活化。③SRF协助MKL1表达，促进MFB分化。
Zhou等[25]在肺纤维化模型大鼠和特发性肺纤维化患者中均观察到Rho/ROCK信号通路的活化，肌动蛋白骨架的聚合和MKL1的核转位。法舒地尔能下调BCL-2表达，激活线粒体凋亡途径，诱导MFB凋亡。在肺炎症损伤后纤维化阶段给予法舒地尔或者切除MKL1基因可以预防实验大鼠肺纤维化的发生。
4 小 结
肺、心脏、肝、肾等器官慢性损伤通过激活Rho/ROCK信号通路及下游信号分子，诱导MFB分化、增殖、收缩、迁移等行为，参与损伤修复，若MFB耐受凋亡并持续处于激活状态则发生纤维化，晚期可引起器官功能衰竭。目前尚无切实有效的抗纤维化药物。Rho/ROCK信号通路抑制剂对纤维化疾病显示了良好的治疗效果，有必要进一步研究。
[1] Ruiz-Loredo AY，Lopez E，Lopez-Colome AM.Thrombin promotes actin stress fiber formation in RPE through Rho/ROCK-mediated MLC phosphorylation[J].J Cell Physiol，2011，226(2)：414-423.
[2] Shimokawa H，Takeshita A.Rho-kinase is an important therapeutic target in cardiovascular medicine[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005，25(9)：1767-1775.
[3] Aburima A，Wraith KS，Raslan Z，et al.cAMP signaling regulates platelet myosin light chain (MLC) phosphorylation and shape change through targeting the RhoA-Rho kinase-MLC phosphatase signaling pathway[J].Blood，2013，122(20)：3533-3545.
[4] Pan PC，Shen MY，Yu HD，et al.Advances in the development of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitors[J].Drug Discovery Today，2013，18(23/24)：1323-1333.
[5] Hu B，Phan SH.Myofibroblasts[J].Curr Opin Rheumatol，2013，25(1)：71-77.
[6] Kulkarni AA，Thatcher TH，Olsen KC，et al.PPAR-gamma ligands repress TGFbeta-induced myofibroblast differentiation by targeting the PI3K/Akt pathway：implications for therapy of fibrosis[J].PLoS One，2011，6(1)：e15909.
[7] Hecker L，Jagirdar R，Jin T，et al.Reversible differentiation of myofibroblasts by MyoD[J].Exp Cell Res，2011，317(13)：1914-1921.
[8] Kach J，Sandbo N，La J，et al.Antifibrotic effects of noscapine through activation of prostaglandin E2 receptors and protein kinase A[J].J Biol Chem，2014，289(11)：7505-7513.
[9] Ishiguro S，Akasaka Y，Kiguchi H，et al.Basic fibroblast growth factor induces down-regulation of alpha-smooth muscle actin and reduction of myofibroblast areas in open skin wounds[J].Wound Repair Regen，2009，17(4)：617-662.
[10] Tsou PS，Haak AJ，Khanna D，et al.Cellular mechanisms of tissue fibrosis 8 Current and future drug targets in fibrosis：focus on Rho GTPase-regulated gene transcription[J].Am J Physiol Cell Physiol，2014，307(1)：C2-13.
[11] Manickam N，Patel M，Griendling KK，et al.RhoA/Rho kinase mediates TGF-beta1-induced kidney myofibroblast activation through Poldip2/Nox4-derived reactive oxygen species[J].Am J Physiol Renal Physiol，2014，307(2)：F159-171.
[12] Lee TM，Lin SZ，Chang NC.Membrane ERalpha attenuates myocardial fibrosis via RhoA/ROCK-mediated actin remodeling in ovariectomized female infarcted rats[J].J Mol Med(Berl)，2014，92(1)：43-51.
[13] Porter KE，Turner NA，O’Regan DJ，et al.Simvastatin reduces human atrial myofibroblast proliferation independently of cholesterol lowering via inhibition of RhoA[J].Cardiovasc Res，2004，61(4)：745-755.
[14] Gu X，Masters KS.Role of the Rho pathway in regulating valvular interstitial cell phenotype and nodule formation[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2011，300(2)：H448-458.
[15] Huang X，Gai Y，Yang N，et al.Relaxin regulates myofibroblast contractility and protects against lung fibrosis[J].Am J Pathol，2011，179(6)：2751-2765.
[16] Tangkijvanich P，Melton AC，Santiskulvong C，et al.Rho and p38 MAP kinase signaling pathways mediate LPA-stimulated hepatic myofibroblast migration[J].J Biomed Sci，2003，10(3)：352-358.
[17] Parizi M，Howard EW，Tomasek JJ.Regulation of LPA-promoted myofibroblast contraction：role of Rho，myosin light chain kinase，and myosin light chain phosphatase[J].Exp Cell Res，2000，254(2)：210-220.
[18] Haak AJ，Tsou PS，Amin MA，et al.Targeting the myofibroblast genetic switch：inhibitors of myocardin-related transcription factor/serum response factor-regulated gene transcription prevent fibrosis in a murine model of skin injury[J].J Pharmacol Exp Ther，2014，349(3)：480-486.
[19] Gellings Lowe N，Swaney JS，Moreno KM，et al.Sphingosine-1-phosphate and sphingosine kinase are critical for transforming growth factor-beta- stimulated collagen production by cardiac fibroblasts[J].Cardiovasc Res，2009，82(2) ：303-312.
[20] Kono Y，Nishiuma T，Nishimura Y，et al.Sphingosine kinase 1 regulates differentiation of human and mouse lung fibroblasts mediated by TGF-beta1[J].Am J Respir Cell Mol Biol，2007，37(4)：395-404.
[21] Vartiainen MK，Guettler S，Larijani B，et al.Nuclear actin regulates dynamic subcellular localization and activity of the SRF cofactor MAL[J].Science，2007，316(5832)：1749-1752.
[22] Zhao XH，Laschinger C，Arora P，et al.Force activates smooth muscle alpha-actin promoter activity through the Rho signaling pathway[J].J Cell Sci，2007，120(10)：1801-1809.
[23] Huang X，Yang N，Fiore VF，et al.Matrix stiffness-induced myofibroblast differentiation is mediated by intrinsic mechanotrans- duction[J].Am J Respir Cell Mol Biol，2012，47(3)：340-348.
[24] Sandbo N，Lau A，Kach J，et al.Delayed stress fiber formation mediates pulmonary myofibroblast differentiation in response to TGF-beta[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2011，301(5)：L656-666.
[25] Zhou Y，Huang X，Hecker L，et al.Inhibition of mechanosensitive signaling in myofibroblasts ameliorates experimental pulmonary fibrosis[J].J Clin Invest，2013，123(3)：1096-1108.
(本文编辑 郭怀印)
南京军区南京总医院(南京210002)
蔡辉，E-mail：njzy_caihui@163.com
R363
A
10．3969/j．issn．1672-1349．2015．16．010
1672-1349(2015)16-1844-04
2015-08-18)
