银杏黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤及缝隙连接蛋白43的作用

魏晓倩，王 雄，赵 慧

银杏黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤及缝隙连接蛋白43的作用

魏晓倩1，王 雄2，赵 慧1

目的 研究银杏黄酮对大鼠心肌缺血再灌注(I/R)损伤(MIRI)及缝隙连接蛋白43(Cx43)的作用，并探讨其可能机制。方法 将32只雄性SD大鼠随机分为假手术组、I/R组、金纳多组、银杏内酯组，每组8只。建立在体心肌I/R损伤模型，HE染色法观察大鼠心肌组织形态学改变；黄嘌呤氧化酶法测定血清超氧化物歧化酶(SOD)活性，硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)浓度；免疫组化法检测Cx 43的表达及分布特点；观察记录再灌注30 min内各组心律失常情况，进行评分比较。结果 与I/R组比较，金纳多组心肌坏死减少，SOD增高、MDA降低，Cx43表达增多且多分布在端端连接处，心律失常发生次数减少；银杏内酯组SOD增高、MDA降低、心律失常评分降低(P>0.05)，心肌细胞坏死及Cx43表达无明显异常。 结论 银杏黄酮可对抗大鼠心肌缺血再灌注损伤以及减少Cx43表达异常，进而改善MIRI性心律失常，其作用机制可能与抗细胞氧化应激及减少缝隙连接蛋白表达异常有关。

缺血再灌注损伤；心律失常；银杏黄酮；氧化应激；缝隙连接蛋白43

目前对于急性心肌梗死的治疗主要为血管再通，随之产生的再灌注损伤越来越被重视，其中再灌注性心律失常也较常见。有研究表明，银杏黄酮具有抗心肌缺血再灌注损伤(MIRI)及抗氯化钡所致心律失常的作用[1-2]。缝隙连接蛋白43(Cx43)表达异常是心律失常发生中较为认可的机制之一[3]。本实验探究银杏黄酮对MIRI的作用以及是否能减少Cx43表达异常，探究可能机制，以期为临床治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 兔抗鼠Cx43多克隆抗体(武汉博士德生物工程公司)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)检测试剂盒(均购于武汉博士德公司)，金纳多注射液(5 mL：17.5 mg；其中银杏黄酮苷4.2 mg，约24%，银杏内酯1.05 mg 约6%，台湾济生化学制药厂股份有限公司)，银杏内酯注射液(2 mL；10 mg；成都百裕科技制药有限公司)，HX 200动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司)，RM6240B型生理实验系统(成都仪器厂)，分光光度计(汉唐仪器厂)，数字病理扫描系统(美国aperio公司Scanscope)。

1.2 动物模型建立 SD大鼠称重，以20%乌拉坦(5 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰位固定，气管插管连接呼吸机，监测Ⅱ导联心电图，开胸暴露心脏，于左心耳根部与肺动脉圆锥中间以下约2 mm处，以6-0无创缝合线穿过冠脉左前降支(LAD)，套管夹毕法阻断LAD血流。以心电图ST段抬高(≥0．15 mV)且相应区域心肌发绀，放松后ST-T回落50%以上，且有心律失常发生为建模成功标准。

1.3 分组及干预措施 将32只雄性SD大鼠随机分为假手术组、I/R组、金纳多组、银杏内酯组，每组8只。假手术组：开胸穿线，麻醉45 min；I/R组、金纳多组及银杏内酯组：开胸穿线，结扎LAD 15 min，再灌注30 min。药物处理措施：金纳多组及银杏内酯组分别于术前3 d腹腔注射金纳多注射液12.5 mg/(kg·d)和银杏内酯注射液2.7 mg/(kg·d)，手术当日缺血前5 min于股静脉分别缓慢推注同前剂量的金纳多注射液和银杏内酯注射液；假手术组及I/R组分别予等量生理盐水。

1.4 观测指标

1.4.1 心肌组织病理学观察(HE染色) 取缺血再灌注心肌组织固定、脱水、包埋、切片、脱蜡，苏木素伊红染色，中性树脂封片，光镜下观察。

1.4.2 血清SOD和MDA测定 再灌注30 min时于腹主动脉取血3 mL，离心，将上清液封存于-20℃冰箱，检测前解冻，按试剂盒说明添加标本及试剂，分光光度计检测A值，计算SOD活性和MDA浓度。

1.4.3 免疫组化法观察Cx43表达及分布 取缺血再灌注心肌组织固定、脱水、包埋、切片、脱蜡，Cx43免疫组化染色，DAB显色、苏木素复染、封片，光镜下观察，扫描、拍照。

1.4.4 心律失常评分 记录再灌注30 min内心律失常的发生，查阅相关文献[4]对各组心律失常进行评分，标准如下：0分：室性早搏(VP)数<5；1分：VP数≥5；2分：只有1次<60 s的室速(VT)；3分：有多次VT，总持续时间<60 s，或只有1次≥60 s；4分：有多次VT，总持续时间≥60 s；5分：可恢复的室颤(VF)；6分：不可恢复VF。

2 结 果

2.1 HE染色 假手术组心肌纤维排列整齐，未见水肿断裂，间质无炎症细胞浸润。I/R组及银杏内酯组心肌纤维排列紊乱，部分断裂，间质高度水肿、有炎症细胞浸润；金纳多组心肌纤维排列基本正常，结构清楚，间质轻度水肿，少量炎细胞浸润。

2.2 血清SOD和MDA测定(见表1) 与假手术组比较，I/R组SOD和MDA差异有统计学意义。与I/R相比，金纳多组SOD和MDA差异有统计学意义；银杏内酯组差异无统计学意义。

表1 4组大鼠SOD活性、MDA含量表(±s)

2.3 免疫组化法观察Cx43表达及分布 I/R组较假手术组表达减少且散乱；金纳多组较I/R组及银杏内酯组表达增多且分布整齐、侧移减少；银杏内酯组和I/R组表达无明显差异。

2.4 心律失常评分(见表2) 与假手术组比较，I/R组室早、室速、室速持续时间、室颤、室颤持续时间等心律失常发生数目均增加，心律失常的评分升高(P<0.05)。与I/R组比较，金纳多组室早等心律失常发生数目均减少，心律失常的评分降低(P<0.05)；与I/R组比较，银杏内酯组室早等心律失常发生数减少，心律失常评分降低，但无统计学意义(P>0.05)。

表2 4组大鼠心律失常发生情况及评分

3 讨 论

1960年Jennings等[5]提出心肌缺血再灌注损伤，且随着血管再通治疗的成熟，对MIRI研究越来越多。目前认为MIRI机制有氧化应激、能量代谢障碍、细胞凋亡等，MIRI会导致心律失常、梗死面积扩大、心功能低下等表现[6]。

有研究表明[6-7]，再灌注时氧自由基会大量产生并蓄积，进而对细胞内蛋白、核酸、心肌细胞膜K+-ATP通道等产生影响，导致心肌细胞损伤以及心律失常的发生。本实验测定氧化应激指标超氧化物歧化酶和氧化应激产物丙二醛，来反应机体自由基的清除能力、受氧化应激的损伤程度；通过HE染色观察细胞坏死情况。实验中I/R组较假手术组氧化应激水平升高(即SOD降低、MDA升高)，细胞坏死更严重；进一步印证氧化应激会导致心肌损伤。与I/R组比较，金纳多组氧化应激水平降低(即SOD活性增加、MDA含量降低)，细胞坏死减少，说明金纳多可抑制氧化应激；而同等含量的银杏内酯未表现出明显的抗氧化应激作用，银杏黄酮可通过抑制氧化应激产生抗MIRI作用。这与沈秀珍等[8]的研究结果一致。

Rakotovao等[7]研究提出I/R产生的氧化应激产物可使Cx43表达减少且去磷酸化，促发心律失常。Cx43是一种主要位于闰盘处的磷蛋白，主要分布在心肌细胞端端连接处，为相邻细胞之间电及化学信号的快速交流通道，其功能状态为磷酸化，分布异常可导致信号传导障碍引发心律失常[3]。本实验观察到I/R组较假手术组Cx43表达减少且分布紊乱，心律失常评分增加；金纳多组较I/R组Cx43表达增加，侧移减少，心律失常评分降低。而银杏内酯组无明显变化。可认为银杏黄酮具有减少Cx43表达异常，改善MIRI性心律失常的作用，这与也与Rakotovao等研究互相印证。

银杏黄酮可对抗大鼠MIRI以及减少Cx43表达异常，改善MIRI性心律失常，其作用机制可能与抗细胞氧化应激及减少缝隙连接蛋白表达异常有关[8]。

[1] 赵艳荣，张国斌，邴飞虹.银杏黄酮对心肌缺血再灌注损伤大鼠的心肌保护作用及其作用机制研究[J]；实用心脑肺血管病杂志，2016，24( 3)：38-42.

[2] 张明艳，韩艳梅，邸丕凡，等.银杏黄酮抗心律失常作用的研究[J]，中国误诊学杂志2003，3(5)：695-696.

[3] 王荣，张存泰，王琳.心脏缝隙连接蛋白Cx43磷酸化水平与室性心律失常的关系[J].中国心脏起搏与心电生理杂志，2007，21(6)：538-540.

[4] 刘丽，向继洲.SIPI926类化合物以及β2-肾上腺素受体激动剂克伦特罗抗缺血-再灌注性心律失常作用及机制[D].武汉：华中科技大学，2011.

[5] Jennings RB，Sommers HM，Smyth GA，et al．Myocardial necrosis induced by temoporary occlusion of a coronary artery in the dog[J]．Arch Pathol，1960，70：68-78；

[6] 郑波，张奇惠，李跃荣.心肌缺血再灌注损伤机制研究进展[J].滨州医学院学报，2008，31(2)：121-123.

[7] Gskotovso A，Tanguy S，Toufektsian MC，et al．Selenium status as determinant of connexin-43 dephosphorylation in exvivo isehemic/reperfnsed ratmyocardium[J]．J Trace Elem Med Biol，2005，9(1)：43.

[8] 沈秀珍，王凌，方毅华.银杏总黄酮通过调节自噬减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的研究[J].安徽医药，2016，20(6)：1065-1067.

(本文编辑王雅洁)

1.山西医科大学在读研究生(太原030001)；2.山西医科大学第一医院

王雄，E-mail：SX wang xiong@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.03.012

1672-1349(2017)03-303-03

2016-11-07)

引用信息：魏晓倩，王雄，赵慧，等.银杏黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤及缝隙连接蛋白43的作用[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(3)：303-305.