心血管疾病是导致人类死亡的主要原因之一，也是导致我国病人猝死的主要原因[1]。随着人们生活水平的提高，心血管疾病的发病率和致死率也呈逐年上升趋势[2-3]。心肌缺血、高血压、高血脂、糖尿病及过度疲劳均是导致心血管疾病的重要因素[4]。近年来大量研究表明，氧化应激诱导的心肌细胞凋亡在心血管疾病发展过程中发挥着重要作用[2， 5]。心肌细胞是一类高度分化的细胞，心肌细胞的凋亡会导致心脏功能减退，最终导致心脏功能衰竭[6]。因此，寻找新的药物抑制氧化应激、减少心肌细胞凋亡是目前心血管疾病治疗研究的热点。白毛夏枯草是我国常用中草药，常用于治疗风湿病、关节炎、胃肠道功能紊乱等疾病，具有较强的抗炎活性[6]。哈巴苷(harpagide， HG) 是白毛夏枯草的主要活性成分，近年来研究表明哈巴苷也具有抗炎活性[7]，并且还能对抗谷氨酸盐诱导的氧化应激损伤，从而抑制大鼠大脑皮层神经细胞的凋亡[8]。但其对心肌细胞氧化应激的作用还少见报道。本研究采用H2O2处理心肌细胞H9c2，诱导心肌细胞氧化损伤，以研究哈巴苷对心肌细胞氧化应激的作用。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 哈巴苷 (货号：6926-080-5) 购自上海一研生物科技有限公司，分子式为C15H24O10，分子量为364.35，纯度≥98%。DMEM/F12培养液 (货号：11330032)、胰酶 (货号：25200114) 和胎牛血清 (货号：12483020) 购自美国Invitrogen公司，Hoechst 33256染色液 (货号：C1027)、RIPA裂解液 (货号：P0013C) 和BCA试剂盒 (货号：P0010) 购自上海碧云天生物科技公司。超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase， SOD，货号：A001-3)、丙二醛 (malondiadehyde， MDA，货号：A003-1)和谷胱甘肽 (glutathione， GSH)试剂盒 (货号：A006-1) 购自南京建成生物工程研究所。Caspase-3(货号：ab13847)、Caspase-9(货号：ab32539)、Bcl-2 (货号：ab182858) 和Bax (货号：ab32503) 一抗和山羊抗兔二抗(货号：ab6721)均购自英国Abcam公司。二氯荧光乙酰乙酸盐(2’，7’-Dichloroflurescein diacetate， DCF-DA， 货号：35845) 购自美国Sigma公司。 哈巴苷的化学结构式见图1。
图1 哈巴苷的化学结构式
1.2 细胞培养 大鼠心肌细胞H9c2购自美国ATCC (货号：CRL-1466)。用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液将H9c2细胞培养于37 ℃ 5% 二氧化碳的细胞培养箱中，并保持湿度在95%以上，2 d换液1次。细胞融合率达到90%以上时对细胞进行传代培养，种板密度为1×104个/mL。
1.3 细胞分组及模型复制 将细胞以1×105个/mL的密度接种于6孔板中，随机分为H9c2组、哈巴苷组、H2O2组和H2O2+哈巴苷组。将细胞培养24 h后，H2O2组和H2O2+ 哈巴苷组加入终浓度为150 μmoL的 H2O2处理3 h，随后哈巴苷组和H2O2+ 哈巴苷组更换为含有4 μmoL 哈巴苷的培养液继续培养24 h，其余两组更换为正常培养液。24 h后收集上清液，保存于-20 ℃冰箱中备用。
1.4 CCK8检测细胞活性 将细胞接种于96孔板中，种板密度为1×105个/mL。将细胞置于培养箱中培养24 h后，每孔加入10 μL的CCK8试剂，重新置于培养箱中培养2 h后检测细胞活性，计算细胞增殖倍数，增殖倍数=细胞吸光度/0 h H9c2组细胞吸光度×100%。
1.5 Hoechst染色检测细胞凋亡 用H2O2和哈巴苷处理细胞并吸走上清液，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次后，每孔加入500 μL的Hoechst染色液，重新置于培养箱继续培养30 min，30 min后用荧光显微镜观察细胞凋亡情况，计算细胞凋亡率，细胞凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数×100%。
1.6 检测SOD、MDA和GSH活性 取出细胞培养上清液置于4 ℃冰箱中待其完全融化后再恢复室温，用离心机以1 200 r/min的转速离心4 min后，取上清液根据试剂盒说明书检测上清液中SOD、MDA和GSH的浓度。
1.7 Western blot检测蛋白表达 用RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白，用BCA试剂盒对蛋白质含量进行定量分析并调平。用12% SDS-PAGE分离蛋白，采用半干法转移蛋白质到PVDF膜，并用5%的脱脂牛奶室温封闭2h。2h后吸去脱脂牛奶，加入Caspase-3(1∶1 000)、Caspase-9 (1∶1 000)一抗、Bcl-2 (1∶1 200)和Bax (1∶1 000)，4 ℃封闭过夜。第2天洗去未结合一抗，加入二抗 (1∶1 200)，室温孵育1 h后，洗去未结合二抗，滴加化学发光显色液曝光显影。以GAPDH为内参，用Image J软件对蛋白质条带进行定量分析。
1.8 二氯荧光素 (DCF)法检测活性氧(ROS)活性 将细胞接种于6孔板中，细胞密度为5×105个/mL。培养24 h后，加入 10 μmoL的DCF-DA，室温孵育10 min后，加入4%的多聚甲醛室温固定细胞5 min，用流式细胞仪检测DCF的荧光强度。
2 结 果
2.1 哈巴苷对心肌细胞增殖的影响 与H9c2组比较，哈巴苷组细胞增殖倍数无明显变化，H2O2组细胞增殖倍数明显降低 (P<0.01)；哈巴苷处理细胞4 d后，与H2O2组比较，H2O2+哈巴苷组细胞增殖倍数明显升高(P<0.05)，表明哈巴苷能减弱H2O2对心肌细胞增殖的抑制作用。详见图2。
与H9c2组比较，*P0.01；与H2O2组比较，#P0.05图2 哈巴苷对心肌细胞增殖的影响
2.2 哈巴苷对心肌细胞凋亡的影响 与H9c2组比较，哈巴苷组细胞凋亡率无明显变化，H2O2组细胞凋亡率明显升高 (P< 0.05)；与H2O2组比较， H2O2+ 哈巴苷组细胞凋亡率显着降低 (P< 0.05)，表明哈巴苷能抑制H2O2诱导的细胞凋亡。详见图3。
2.3 哈巴苷对凋亡蛋白表达的影响 与H9c2组比较，H2O2组细胞Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P< 0.05)，Bax表达水平明显升高 (P< 0.05)；与H2O2组比较，H2O2+ 哈巴苷组细胞Bcl-2表达明显增多，Bax表达显着减少 (P< 0.05)。详见图4。H2O2还能显着促进H9c2细胞凋亡相关蛋白Caspase-3和Caspase-9的表达 (P< 0.05)，能显着减弱H2O2诱导Caspase-3和Caspase-9表达的作用 (P<0.05)，表明哈巴苷能对抗H2O2诱导的心肌细胞凋亡。详见图5。
2.4 哈巴苷对氧化应激的影响 H2O2组H9c2细胞的DCF荧光强度与H9c2组比较明显升高 (P<0.05)，表明H2O2能诱导ROS的产生；H2O2+ 哈巴苷组细胞DCF荧光强度明显低于H2O2组 (P<0.05)，表明哈巴苷能减弱H2O2诱导ROS产生的作用。与H9c2组比较，哈巴苷组细胞上清液SOD、MDA和GSH的含量无明显变化，H2O2组细胞上清液SOD和GSH的浓度明显降低 (P< 0.05)，MDA浓度明显升高 (P< 0.05)；H2O2+ 哈巴苷组细胞上清液SOD和GSH含量与H2O2组比较显着升高 (P< 0.05)，MDA浓度明显降低 (P< 0.05)，提示哈巴苷能抑制H2O2诱导的氧化应激，从而抑制心肌细胞凋亡。详见图6、图7。
3 讨 论
既往研究认为，细胞坏死是心肌损伤的主要方式，但近年来研究发现，细胞凋亡也是心肌细胞损伤的另一主要方式[9]。大量研究发现，心脏病病人心肌受损的中心区域和周围组织均出现了大量的心肌细胞凋亡，表明心肌凋亡也是导致心肌梗死的主要原因之
一[10]。因此，抑制心肌细胞凋亡是治疗心血管疾病的关键。近年来研究表明，多类中药提取物都具有心肌保护作用。蛇床子提取物蛇床子素能抑制阿霉素诱导的心肌细胞凋亡[11]，川芎提取物能通过抑制心肌细胞凋亡提高心力衰竭大鼠的心脏功能[12]。哈巴苷是白毛夏枯草的主要活性成分，能通过促进GSH表达，抑制一氧化氮的分泌抑制神经元细胞氧化应激，减少神经元的凋亡[8]，但其对心肌细胞的作用还未见报道。
H2O2是一类ROS，常被用于诱导心肌缺血和心肌缺血再灌注等心血管疾病模型[13]。研究表明，ROS可通过抑制Bcl-2表达，并促进Bax转移至线粒体诱导细胞色素C的释放，从而上调Caspase家族蛋白的表达，启动线粒体细胞凋亡程序[13]。Caspase家族蛋白是细胞凋亡的最终执行者，其中Caspase-3和Caspase-9是细胞凋亡的最重要调控分子[14]。因此，本研究采用H2O2处理心肌H9c2细胞发现，H2O2能显着抑制心肌细胞增殖并能促进心肌细胞H9c2凋亡，诱导Caspase-3和Caspase-9的表达。哈巴苷具有显着减弱H2O2抑制心肌细胞增殖、诱导心肌细胞凋亡的作用，并能抑制Caspase-3和Caspase-9的表达。此外，H2O2还能明显上调H9c2细胞Bax的表达水平，降低Bcl-2的表达水平，哈巴苷能显着减弱H2O2对Bcl-2和Bax表达的调控作用，提示哈巴苷能对抗H2O2诱导的心肌细胞凋亡。
与H9c2组比较，*P 0.05；与H2O2组比较，#P 0.05图3 哈巴苷对心肌细胞H9c2凋亡的影响
与H9c2组比较，*P<0.05；与H2O2组比较，#P<0.05图4 哈巴苷对Bcl-2和Bax蛋白表达的影响
与H9c2组比较，*P 0.05；与H2O2组比较，#P 0.05图5 哈巴苷对H9c2细胞Caspase-3和Caspase-9表达的影响
与H9c2组比较，*P0.05与H2O2组比较，#P 0.05图6 哈巴苷对ROS表达的影响
与H9c2组比较，*P 0.05；与H2O2组比较，#P 0.05图7 哈巴苷对H9c2细胞SOD、GSH和MDA分泌的影响
氧化应激损伤是导致心肌细胞凋亡的主要原因之一。在慢性心力衰竭、心肌缺血等许多心血管疾病中均会出现氧化应激损伤[15]。ROS是诱导氧化应激的主要活性分子，主要由线粒体分泌产生[16]。ROS可直接导致线粒体膜破坏，使线粒体膜通透性增加，出现水肿，直接导致细胞凋亡程序的启动[17]。同时ROS还能抑制抗氧化酶的产生。已有研究表明，ROS直接导致心肌细胞凋亡和坏死[18]。因此，有效地抑制氧化应激将有利于心血管疾病的治疗。H2O2能通过促进线粒体细胞色素C的释放诱导凋亡基因的表达，从而促进细胞凋亡[2]。本研究采用DCF-DA法检测了H9c2细胞内ROS活性，实验结果表明，H2O2作用于H9c2细胞能显着提高细胞内ROS的活性，提示H2O2能诱导H9c2细胞氧化应激。哈巴苷能显着减弱H2O2对ROS活性的诱导作用，提示哈巴苷具有一定的抗氧化损伤活性。MDA是典型的细胞膜脂质过氧化产物，与细胞损伤程度呈正相关；SOD是一类抗氧化酶，GSH是人体内重要的还原剂，两者均能清除细胞内的ROS，从而减轻细胞氧化应激损伤[14]。本研究发现，H2O2能显着抑制抗氧化酶SOD和还原酶GSH分泌，促进MDA的分泌，进一步表明H2O2能诱导H9c2细胞氧化应激，哈巴苷能显着降低细胞上清液中MDA浓度，升高SOD和GSH浓度，同时还能抑制ROS的产生，表明哈巴苷具有抗心肌细胞氧化应激的能力，从而抑制心肌细胞凋亡。
综上所述，哈巴苷能抑制H2O2诱导的心肌细胞凋亡率，降低凋亡相关蛋白Bax、Caspase-3和Caspase-9的表达水平，并能促进凋亡抑制基因Bcl-2的表达，同时还能升高细胞上清液中SOD和GSH的浓度，降低MDA浓度并抑制细胞内ROS的活性，表明哈巴苷能通过抑制氧化应激抑制心肌细胞凋亡，发挥细胞保护作用。本研究探究了哈巴苷对氧化应激诱导的心肌细胞凋亡的作用，以期为心血管疾病的治疗提供新的潜力药物依据。
