林丰夏，李 亮，曾志聪，宋银枝

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是冠心病、脑梗死等心脑血管疾病发病基础，因其有非常高的发病率和死亡率，所以引起广泛重视[1]。尽管以调脂、抗血小板凝聚等为核心的动脉粥样硬化疾病的防治手段不断推进，但AS仍是威胁发达国家与发展中国家人类健康的“罪魁祸首”。近年来中医药在动脉粥样硬化性疾病防治上取得许多可喜成果。辨证论治是中医学的特色，在AS的中医诊治中具有关键性的作用。对于AS的辨证分型存在地域性差异，温暖潮湿的岭南地区病人则以湿热证为主[2]，而寒冷的西北地区病人以阳虚证多见[3]。不同证型的AS，遣方用药可截然相反。对于中医药的研究不能停留在“只见树木不见森林”的程度，在实验研究中坚持“整体观”与“辨证论治”原则，可让传统医学与现代生命科学领域充分接洽。因此完成“湿热证”与“阳虚证”AS动物模型的建立，在研究AS不同证型的病理特征及验证中医辨证论治的思想有重要意义。随着“湿热证”与“阳虚证”AS模型的建立，将进一步了解不同证型AS的病理特点。对于湿热证的AS模型，在其模型上使用小檗碱等清热祛湿药物是“正治”，其效果是否较“阳虚证”AS模型好？若在“湿热证”AS模型使用已证实具有改善AS的辛温通阳药物(如葱白提取物等[4])还能否取得良好效果？这些设想将在“湿热证”与“阳虚证”AS模型建立的基础上进一步明确中医辨证论治的重要性。

鉴于此，本研究通过对既往文献的检索、阅读、理解提炼，加入简单评述，探讨建立动脉粥样硬化疾病中常见的两种中医证型(湿热证、阳虚证)动物模型的建立方法，为进一步揭示中医中药在防治动脉粥样硬化中的作用机制提供帮助。

1 AS实验动物选择

AS是一种慢性的血管病变，建模时间一般较久，故需要选择与人类的血管解剖特点相似、生命力及抗感染能力较强的实验动物。常用的动物模型包括大鼠、小鼠、兔、小型猪等。

1.1 大鼠 大鼠容易饲养，生命力顽强，且大鼠为杂食性动物，食性特点与人类相似，手术耐受性好[5]。因此基于大鼠建立AS模型的研究较多，如邢玉桂等[6]利用8周龄的Wistar大鼠，经高脂高糖饮食+维生素D3灌胃8周后，成功制作出动脉粥样硬化大鼠模型；赖玲等[7]利用健康成年的SD雄性大鼠，高脂饮食+维生素D3+L-甲硫氨酸喂养4周、6周、8周后，SD大鼠分别出现了动脉粥样硬化早、中、晚期的典型改变。有学者应用高脂饮食配合免疫损伤，比较了HFJ近交系大鼠与Wistar封闭群大鼠在AS模型建立中的优劣，结果发现HFJ大鼠造模成功率优于Wistar大鼠，可作为新一代的AS动物模型[8]。但HFJ大鼠体形及动脉较小，无胆囊，对外源性胆固醇吸收差，具有抗实验性 AS 特性等不利因素[5]，制约了其进一步发展。

1.2 小鼠 基于小鼠建立的 AS 动物模型的研究最为广泛，主要是因为小鼠的病变过程与人类相似，另外小鼠价格低廉、饲养成本低、易于繁殖、可进行基因操作的特点也很大程度上促进了小鼠的应用。同时其发病周期相对较短，这有利于观察与操作[9]。随着基因工程技术的进步、转基因与基因敲除等技术的出现，诞生的新型转基因AS模型小鼠更具有独特优势。载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)缺陷株(ApoE-/-)小鼠和低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)受体缺陷株(LDL-R-/-)小鼠是当前研究、应用最成熟的模型小鼠。ApoE-/-小鼠在正常的饮食情况下也会自发出现动脉粥样硬化，配合高脂饲养能更快产生易损斑块或形成血栓，AS模型的成功概率会明显增加[10]。但ApoE-/-小鼠缺乏在人类AS病变过程中非常重要的LDL，其血浆中的胆固醇主要被脂蛋白残粒所运载而非LDL，且ApoE蛋白同时还具有影响免疫功能及巨噬细胞、脂肪组织的生理功能，而这些均参与AS形成过程，所以将分析其具体机制[11]。 LDL-R-/-小鼠的优势在于LDL受体(LDLR)蛋白的缺失主要影响脂蛋白的摄取和清除，较ApoE-/-具有功能单一性，但LDL-R-/-小鼠不采用高脂高糖饮食难以产生满意的AS模型，造模成功的概率相对较低[12]。总之，转基因小鼠经过高脂饮食喂养后容易产生AS模型且病变过程与人类相似，近年来已成为AS动物模型制作的主要实验动物。

1.3 猪 猪不但心脏、血管等结构在解剖和功能，包括血液学特点和血液的生化指标，都与人类极其相似。而且其脂质代谢机制也和人类相仿，其形成AS斑块的分布、组织结构和发病机制也与人类相近[13]。以往受限于家猪的较大体型、饲养管理与操作困难、维持成本高、研究者不熟悉等缺点，其应用不广泛。但近年来培育的小型猪相对解决了这些不足，应用小型猪制作动脉粥样硬化模型的研究越来越多。李艳君等[14]通过高脂、高热量方法饲养广西巴马小型猪半年，发现其主动脉、颈动脉、腹动脉内膜均明显增厚，内膜下可观察到少量的泡沫细胞，并且观察到动脉粥样硬化指数值达到3.8以上并维持3个月，即可初步认定AS模型建立成功。

1.4 其他AS动物模型 目前报道的文献，还有利用兔、鸽、猴子、鹌鹑等实验动物制作AS动物模型。兔对外源性的胆固醇吸收率高，且体内脂质不易清除，采用不同的饲养方法可形成不同的AS类型，且具有大小合适、喂养成本相对可接受等特点，但因为其是食草动物，不能自发形成AS动物模型，免疫力低下，死亡率较高，造模周期长等不足限制了其应用[5]。田卉等[15]利用高脂+烟酰水杨酸75 mg/(kg·d)喂养鹌鹑6周后，高脂喂养的两组动物血清总胆固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(how density lipoprotein cholesterol，HDL-C)升高，动脉斑块发生率达到100%，但其缺点在于血管特点与人类不相近。猴子经过高脂高胆固醇饲料喂养后，可产生与人类类似的AS病变[16]，但猴子作为灵长类保护动物，价格昂贵，使用受到限制。

2 AS动物模型复制方法

AS相关的研究很多，根据AS不同的发病机制，AS动物模型的制作方法也很多。比如基于脂质浸润学说，采用高脂高胆固醇喂养的方法被研究者广泛使用；基于内皮损伤反应学说，采用机械损伤的方法制作AS模型；基于免疫损伤学说，采用免疫损伤法等。各种复制方法均有其优缺点。

2.1 高脂高胆固醇饲喂法 基于脂质浸润学说，采用高脂饮食的喂养方法，接近人类饮食，制作成功的AS动物模型病变特点近似人类。文依等[17]将胆固醇溶解于乙醇后与普通饲料混匀配成高胆固醇饲料(1.5 g胆固醇配148.5 g普通饲料)，喂养新西兰兔12周后成功造模；李淑莲等[18]在普通饲料中添加10 %胆固醇和20 %猪油乳剂，连续喂养日本大耳白兔8周成功造模。但目前在饲料成分种类、配伍比例未达成共识，而且造模时间较长，这均为其缺点。

目前常用混合型饲料的喂养方法，该法克服了单纯高脂饮食喂养的动物模型病变血管无钙质沉积缺陷，并且可以加速AS的形成，缩短试验周期。赖玲等[7]利用高脂饮食+维生素D3+L-甲硫氨酸喂养健康成年的SD雄性大鼠，其中模型组分为3组，模型一组采用30%蛋黄粉、25%花生、34.3%基础饲料、0.7%矿物质维生素、10%猪油喂养；模型二组采用3%胆固醇、0.5%胆酸钠、0.2%丙硫氧嘧啶、5%白糖、10%猪油、81.3%基础饲料喂养；模型三组采用1%胆固醇、0.4%胆酸、5%猪油、93.6%基础饲料喂养，在第4周、第6周、第8周测定大鼠血脂，发现模型组大鼠血清 TG、TC 和 LDL与对照组相比均呈现上升趋势，而高密度脂蛋白(HDL)则呈下降趋势，高脂饮食+维生素D3+L-甲硫氨酸三则联合的方法最终加速了AS的形成，且认为模型一组喂养方式形成的模型更适合建立AS早中晚模型，适用于基础、临床多方面研究。

2.2 机械损伤法 基于内皮损伤反应学说，采用机械损伤的方法刺激内皮细胞致其大量损伤，从而导致内皮功能发生紊乱，产生一系列的炎症反应和内膜反应，最终可形成AS。目前有采用球囊法、气体干燥法、辐射损伤法成功制作AS模型的报道，其中采用球囊法的报道相对较多。杨炯等[19]利用短期的高脂饮食喂养+球囊损伤的方法成功建立了ApoE-/-小鼠AS模型，且认为该法造模具有周期短、斑块形成稳定、病变部位明确、与人类AS性质接近等优势，可作为AS小鼠模型更为合适的造模方法，适用于血管再狭窄的研究。但是球囊法造模也有其缺点，包括技术操作要求高、所形成的斑块易破裂而形成血栓，球囊的应用不当可能会造成动脉破裂后果。艾志兵等[20]采用高脂饮食联合气体干燥法，在高糖高胆固醇饲养日本大耳白兔1周后于颈动脉处进行气体干燥术，术后继续高脂饮食喂养，结果发现在第4周、第6周即可出现颈病变。目前关于气体干燥法在干燥的时间、气体用量方面没有达成统一的标准，有待进一步研究。

2.3 免疫损伤法 基于免疫损伤学说，许多学者采用免疫损伤制作AS模型，取得一定成果。张勇等[21]通过静脉注射牛血清白蛋白(250 mg/kg)+高脂饮食喂养干预日本大耳白兔3周后，血清中TC、LDL-C明显升高，6周后，肉眼及光镜下都发现明显的动脉粥样斑块；连伟光等[8]则利用通过牛血清白蛋白(40 mg/kg) 和卵清白蛋白(2.5 mg/kg)进行免疫损伤，并辅以维生素D3(250 U/g)灌胃，经高脂饮食喂养90 d后，成功建立HFJ近交系大鼠AS模型；王卫群等[22]在1周、3周分别经新西兰白兔鼻腔感染肺炎衣原体，发现肺炎衣原体感染与高脂饮食能诱发及加快AS病变进程。此外许多学者采用内毒素、鼠伤寒沙门氏菌等作为炎性刺激导致免疫损伤，而成功建立AS模型[23-24]。

3 AS中医湿热证模型

中医湿热证包含外感湿热与内伤湿热，常见的证型有脾胃湿热证、肝胆湿热证、湿热下注证等。在湿热证的形成上，吴鞠通认为“内不能运化水谷之湿，外复感时令之湿”，薛生白则有“太阴内伤，湿饮停聚，客邪再至，内外相引，故病湿热”的精彩论述。由此可见湿热证以脾胃为中心，内伤外感共作而致病。《内经·素问·太阴阳明论》：“脾者土也，治中央，常以四时长四藏，各十八日寄治”。长夏为四时之余气，五脏归属于脾，脾主运化水湿。所以根据这些理论，多数学者在制作湿热证模型时，多注意模拟长夏的气候特点，改变模型动物喂养环境的湿度和温度，增加其外感湿热邪毒的机会；同时应用高脂饮食喂养，制造饮食失节、过食肥甘厚腻的办法损伤脾胃，致实验动物脾胃失其运化，达到产生内湿的目的。

吴仕九等[23]提出了饮食+气候+生物因子(鼠伤寒沙门氏菌)的造模方法，将大鼠高热量、高胆固醇喂养10 d后放入气候箱(温度35 ℃，相对湿度95%)96 h，再灌胃给子鼠伤寒沙门氏菌2 mL/200 g，120 h后再加强感染1次(1 mL/200 g)，成功复制湿热证模型，并且认为其模型从病因模拟、症状体征表现都与中医湿热证型相近，且有可重复性及可操作性的优势[23]。杨开清等[24]以高胆固醇饲料喂养6周+从耳缘静注内毒素(1 pg/kg，每周1次)的方法，成功制作了新西兰大白兔湿热证AS模型，并且认为湿热内蕴是动脉粥样硬化(特别是早期)重要的发病机制，湿热进一步致瘀，所以采用清热化湿消瘀法是AS治疗的主要方法。

总之，依据湿热证形成中以脾胃为中心，内外合邪而致病理论，结合目前常用制造AS动物模型的方法中高脂饮食喂养方法，加上增加动物生活环境湿度和热度产生湿热外邪，可以成功制作既具有中医湿热证典型特点，又符合AS病理改变特点的AS动物模型。

4 AS中医阳虚证模型

中医阳虚证主要包括心阳虚、脾阳虚、肾阳虚及多者相兼为病。关于阳虚证形成，《黄帝内经·素问·阴阳应象大论》中提到“阴胜则阳病，阳胜则阴病”，基于此中医多认为阳虚证的形成与过食生冷、久居阴冷潮湿之地、久病阳气耗伤等后天因素和先天禀赋不足有关。气属阳，气虚为阳虚之渐，阳虚为气虚之极，气作为运行于生命周身的无形精微物质，是保持机体生命活力的力量源泉。气为血之帅，血为气之母，气行则血行，气虚、阳虚无力推动血液运行则血为之瘀，正如《仁斋直指方·血荣气卫气论》所说：“盖气者，血之帅也。气行则血行，气止则血止，气温则血滑，气寒则血凝，气有一息之不运，则血有一息之不行。”关于阳虚血瘀导致血府(脉管)病变，《灵枢·九针论第七十八》有载“邪入于阴，则为血痹。”《诸病源候论》中亦有记载：“血痹者，由体虚邪入于阴经故也。血为阴，邪入于血而痹，故为血痹也。”《医林改错·下卷》中也指出：“元气既虚，必不能达于血管，血管无气，必停留而癖。”基于这些理论，多数学者在复制阳虚证动物模型时多通过制造阴冷潮湿的环境、饮食不节等制造阳虚证形成的后天因素，或者通过手术等方式制造阳虚证形成的先天不足因素，以此形成外感寒湿等伤其阳气、先天不足阳气不充格局，达到复制阳虚证动物模型的目的。

如李芹等[25]系统综述了脾阳虚证动物模型的建立方法，包括利用苦寒泻下药(大黄、番泻叶等)灌胃、将动物模型放置在寒湿环境中、连续喂养的饮食失节等法模拟外感内伤病因均能成功制造脾阳虚证模型；还有通过注射利血平等西药建立脾阳虚模型，并且认为评价脾阳虚模型的症状指标包括纳差、倦怠少动、大便溏泄、皮毛枯槁、肛温下降、喜聚堆等。氢化可的松等激素注射及切除动物一侧肾脏、肾上腺、睾丸等手术方式也可成功制作阳虚证动物模型[26]。唐汉庆等[27]通过手术切除Wistar大鼠肩胛骨棕色脂肪后1周，在19 ℃的环境刺激下，饲以高脂饲料后大鼠出现畏冷寒战、喜扎堆、纳差、便溏等阳虚症状或体征，成功制作冠心病心脾阳虚证。于柏青等[28]利用人工气候箱模拟西北寒冷干燥环境[人工气候箱系统温度设定为(6±2)℃，相对湿度控制在25%～32.8%]，配合高脂饮食成功建立阳虚证AS模型。

通过对目前已发表的文献检索发现，复制阳虚证动物模型的方法很多，复制动脉粥样硬化阳虚证模型的研究则非常少，个别的报道散在冠状动脉粥样硬化性心脏病、下肢动脉粥样硬化性疾病等研究中。基于气虚血瘀、阳虚血瘀、阳虚寒凝等理论，以及临床动脉粥样硬化性疾病气虚、阳虚证型的较高发病率，许凌之等[3]分析1 264例动脉粥样硬化病人的中医证候，提示以气虚、阳虚为主证，或兼有气虚、阳虚证的病人比例达到42.09%。因此探索建立具有阳虚特点的动脉粥样硬化动物模型具有重要意义。

5 小结与展望

医学动物模型的出现是人们了解疾病发生发展的本质，了解人体生理病理的一把利剑，医学动物模型的出现是当今医学飞速发展的一个重要原因，建立医学动物模型是为了更好地防治疾病、服务临床，为人类健康保驾护航，但是无论是建立何种医学动物模型，复制出的模型与疾病表现在人类身上的征象都有一定的差异。所以建立医学动物模型的关键，必须基于研究的目的，遵循目前以了解的疾病发病机制，采取合适的方法尽可能模拟近似人类疾病病理特点的动物模型。因此，无论是建立何种证型的AS动物模型，都必须符合AS的发病机制，符合中医病因病机特点。基于湿热证脾胃为中心，内外合邪的致病理论，造模过程中尽可能地模仿内湿外湿致病的先后天因素；基于阳虚证阴胜则阳病的理论，造模也要尽可能地营造能导致阳虚的先后天条件，如此复制出的AS动物模型才能更好地服务于基础研究、临床研究。

目前AS动物模型的造模途径很多，选用的材料与方法各异，模型动物的选择上，有用大鼠、小鼠，也有用兔、猪、鸽、猴子、鹌鹑等，各小类之间又有不同的区别，它们各有自己优缺点，随着科学技术的发展，越来越先进的动物模型会不断涌现，就目前来说，ApoE-/-与 LDL-R-/-等基因敲除小鼠因具有病变过程与人类相似、易于繁殖、维持成本低等优势，是建立AS模型较好的选择。在造模方法上，目前方法很多，多数方法都没有形成统一的标准，比如高脂高胆固醇饲料在具体配伍方面各学者采用不同的比例都成功复制了AS动物模型，一方面说明通过高脂高胆固醇饲喂的方法成功率高、灵活性大，另一方面也说明如何配置出更符合人类饮食特点、尽可能地节约资源、加速AS形成的相关研究欠缺。又比如在构造动物生活环境上，在湿度、温度等方面采用怎样的干预措施也有待进一步研究。同时目前也注意到，在湿热证与AS的研究方面相对较多，构造具有湿热证特点的AS动物模型方法相对较多，而在阳虚与AS结合的研究则很欠缺，如何构造具有中医阳虚证特点的AS动物模型是今后应该努力的方向。随着“湿热证”与“阳虚证”AS模型的建立，将了解不同证型AS的病理特点。并且基于两个截然相反的证型，可进一步探讨“寒者热之，热者寒之”及“同病异治”的中医特色理论的科学依据。