赵 康，赵煦萌，徐盼盼，张瑛琪
人的大脑对缺氧极为敏感，当脑组织发生缺血时，会使局部的脑组织和功能产生损伤，其损伤程度和缺血时间以及血流速度有密切关系[1]。短时间局部缺血只会产生可逆性的损伤，但是若长时间并且完全缺血则可能出现脑梗死[2-3]。当脑出现缺血/再灌注时也会对大脑功能产生严重损伤。当大脑出现缺血时，脑细胞中的生物电会随之发生改变，产生病理性的慢波，缺血一段时间后再进行灌注，慢波会持续存在并加重，与此同时，神经递质也会发生显着变化，随着脑缺血/再灌注时间的增加，其兴奋性氨基酸会随之降低，而抑制性氨基酸则随之升高[4-6]。发生缺血/再灌注的时间越长，其兴奋性神经递质的含量就越低，脑组织结构发生改变就越明显。据文献报道，脑缺血/再灌注的发病原因与自由基、钙超载、兴奋性氨基酸、炎症反应等因素有关[7]。有研究发现，环磷酸腺苷(cAMP)-蛋白激酶A(PKA)-环磷腺苷反应元件结合蛋白(CREB)信号转导通路对脑缺血发挥重要作用，cAMP信号通路能够对缺血的脑组织起到保护作用。黄芪为豆科植物黄芪的干燥根，是治疗心脑血管疾病的常用中药，发挥作用的主要成分为黄芪甲苷。据文献报道，黄芪甲苷具有增强抗脑缺血/再灌注的作用[8-9]。本研究探讨黄芪通过调节cAMP通路对脑缺血/再灌注大鼠神经功能的影响。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物与药物 成年清洁级SD大鼠60只，体重220～280(245±25)g，月龄3～4(3.0±0.4)个月。大鼠均由武汉华联科生物技术有限公司提供，动物合格证号为SCXK(湘)2017-0003。黄芪甲苷，规格：每瓶500 mg，批号：20170425，购于四川省维克奇生物科技有限公司。纯度≥98%，用5%羧甲基纤维素钠配制成混悬液使用。
1.2 分组、给药及造模 将60只大鼠随机分为3组：假手术组、模型组、黄芪甲苷组，每组20只。3组大鼠一般情况比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。黄芪甲苷组给予黄芪甲苷10 mg/kg灌胃；假手术组和模型组给予生理盐水10 mL/kg灌胃，每日1次，连续7 d后黄芪甲苷组和模型组制作脑缺血模型即大脑中动脉栓塞(MCAO)模型，腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/kg)对大鼠进行麻醉处理，随后将大鼠仰卧固定，去除颈部皮毛，在颈部的正中位置切2 cm长切口，将颈总动脉和迷走神经充分暴露和分离，结扎颈总动脉，制造脑缺血，20 min后停止结扎恢复血流，再灌注24 h。假手术组同上述方法进行手术，但不对其进行脑缺血和再灌注处理。造模结束后，可通过观察大鼠抬尾时是否前肢正常向地面用力，瘫痪的前肢是否能够正常屈伸等，来判断造模是否成功。
1.3 观察指标
1.3.1 神经功能 从每组随机选取5只大鼠，按照改良神经功能评分(Modified Neurological Severity Scores，mNSS)的标准及方法，于造模后1 d、7 d、14 d进行神经功能评分。通过观察大鼠的行为活动、平衡感以及反射程度等对大鼠的神经功能进行评分，评分13～18分的大鼠进入实验。功能正常用0分表示，有功能损害用1分表示，功能损害最严重用22分表示；评分越高，神经功能损害越严重。
1.3.2 脑梗死体积 脑缺血/再灌注后24 h，从每组选取5只大鼠，在无菌条件下断头取脑组织将其放置在-20 ℃冰箱进行冷冻，脑组织变硬后，用刀片对脑组织进行冠状位切片，每片厚度2 mm。将脑组织切片放置在1%氯化三苯四氮唑磷酸缓冲液中进行染色。正常脑组织与氯化三苯四氮唑反应呈现出红色，而缺血脑组织不能与之进行反应，所以脑梗死组织则呈现出白色。利用分析软件计算脑梗死面积，进而计算出脑梗死体积，脑梗死体积=脑梗死面积之和×切片厚度(2 mm)。
1.3.3 酶联免疫吸附实验法测定大鼠血清中酶活性变化 采集大鼠腹主动脉血样，4 000 r/min离心5 min，取上清液并将其放置在4 ℃下保存备用。具体操作方法参考试剂盒内所附说明书进行操作。使用酶标仪在450 mm下对其吸光度值进行测定，利用标准品的吸光度值，于EXCEL软件中制作标准曲线，由曲线计算出样品中cAMP、腺苷酸环化酶(AC)和PKA的活性变化。
2 结 果
2.1 3组大鼠神经功能评分比较 假手术组大鼠没有出现神经功能损伤；与模型组比较，黄芪甲苷组脑缺血/再灌注后7 d、14 d神经功能评分降低(P<0.05)，随着脑缺血/再灌注后时间延长，黄芪甲苷组神经功能评分呈降低趋势。详见表1。
组别只数1 d7 d14 d假手术组 50.000.000.00模型组 514.86±2.1712.46±2.05 10.35±2.11 黄芪甲苷组513.97±2.189.57±2.05①6.78±2.16①
与模型组同期比较，①P<0.05。
2.2 3组大鼠脑梗死体积比较 脑缺血/再灌注后24 h，假手术组无脑梗死，模型组和黄芪甲苷组的脑梗死体积分别为(37.39±3.06)%、(16.38±1.67)%，差异有统计学意义(P<0.05)。
2.3 3组大鼠血清中酶活性比较 与模型组比较，黄芪甲苷组大鼠血清中cAMP、AC和PKA活性较高，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。
组别只数cAMPACPKA假手术组 511.00±0.0927.00±0.42362.00±0.84模型组 510.00±0.0323.00±0.53348.00±0.43黄芪甲苷组512.00±0.80①25.00±0.54①391.00±0.06①
与模型组比较，①P<0.05。
3 讨 论
据文献报道，脑缺血后，促进神经的发生有利于病人后期预后神经功能的改善，当对神经发生进行抑制，会加重脑缺血[10-12]。在正常生理状态时，已经出现活化PKA会催化亚基，使得CREB出现磷酸化过程，抑制转录因子活性来对外界刺激产生应激反应[13-16]。cAMP-PKA-CREB通路在神经细胞兴奋、生长、凋亡及重塑全生命周期过程中均发挥重要作用，出现脑缺血症状后，cAMP-PKA-CREB通路中的各个关键因子活性会受到影响，对神经元的内生长状态产生不利影响，从而抑制神经元轴突再生[17-19]。
本研究结果显示，与模型组比较，黄芪甲苷组大鼠血清中cAMP、AC和PKA的活性较高，差异均有统计学意义(P<0.05)。假手术组大鼠没有出现神经功能损伤；与模型组比较，黄芪甲苷组脑缺血/再灌注后7 d、14 d神经功能评分降低 (P<0.05)，随着脑缺血/再灌注后时间延长，黄芪甲苷组神经功能评分呈降低趋势。脑缺血/再灌注后24 h，假手术组无脑梗死，模型组和黄芪甲苷组的脑梗死体积分别为(37.39±3.06)%、(16.38±1.67)%，差异有统计学意义(P<0.05)。其作用途径可能是脑缺血后处于神经元突触位置的γ-氨基丁酸B受体(GABAB)会被激活，然后与G蛋白进行偶联，此时，会对兴奋性神经递质分泌产生抑制作用，使机体发生抑制性反应，GABAB受体可使细胞内的cAMP浓度降低，从而使神经元突触部位的囊泡聚集困难[20-21]。当GABAB和G蛋白进行结合后，会对AC的激活产生抑制，使AC联合三磷酸腺苷(ATP)生成cAMP的过程受到抑制，从而使机体内的cAMP浓度降低，最终使得PKA催化亚基由细胞核转移至细胞浆内，而且和保留在细胞浆的调节亚基重组为无活性的PKA全酶，随之导致PKA失活[13-14]。
综上所述，黄芪可以调节cAMP通路中的相关蛋白来减少脑缺血/再灌注小鼠脑梗死面积，改善大鼠神经功能。
