川芎嗪对压力超负荷诱导大鼠心肌肥厚信号转导系统MAPK通路的影响

戚丹凤

心肌肥厚是由特发性心肌病、心肌梗死、肺动脉高压、心脏瓣膜病等引起的，心脏长期超负荷诱发的一种病理代偿反应[1]，以心肌细胞肥大、蛋白质含量升高、间质成分异常等为主要病理特征。心肌肥厚是多种心血管疾病的独立危险因素[2]，引起心肌收缩、舒张功能下降，长期存在发展为失代偿，可转化为心力衰竭、心源性猝死、恶性心律失常等严重疾病，极大增加病人死亡率[3]。血管紧张素转换酶抑制剂、β-受体阻滞剂、钙拮抗剂、醛固酮受体拮抗剂等是临床治疗心肌肥厚广泛使用的药物，可一定程度改善病人症状，但对降低死亡率无明显效果，且长期使用副作用明显。寻找安全有效的药物以防治和逆转心肌肥厚是目前临床研究热点。朱广旋等[4]研究发现，中药以多靶点、生物活性成分丰富的优势成为研发治疗心肌肥厚新药的主要来源。川芎嗪为中药川芎的酰胺类生物碱成分，对多种心血管疾病具有良好的防治作用[5]，但具体作用机制尚不明确。本研究观察川芎嗪对压力超负荷诱导大鼠心肌肥厚信号转导系统丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 清洁级健康雄性SD大鼠78只，体质量220～260(243.74±13.57)g，购自浙江省实验动物中心，动物许可证号：SCXK(浙)2014-0001。所有大鼠分笼饲养于动物饲养室内，每笼5只，饲养室内安静，定时通风换气，温度22～25 ℃，相对湿度为65%左右，昼夜节律为12 h，饲以充足的普通标准饲料和蒸馏水，大鼠自由活动、进食，每周更换3次垫料。

1.1.2 实验材料、药品与试剂 川芎嗪，CAS号：1124-11-4，纯度：HPLC≥98%，货号：C-045，规格：每支20 mg，购自成都瑞芬思生物科技有限公司，使用时采用二甲基亚砜(DMSO)溶解，后采用蒸馏水稀释配制成浓度为5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL的川芎嗪溶液，现用现配；缬沙坦片(规格：每片40 mg，批号：20170325，购自常州四药制药有限公司)，使用时采用DMSO溶解，后采用蒸馏水稀释配制成浓度为2 mg/mL的缬沙坦溶液，现用现配。DMSO，购自北京智杰方远科技有限公司；磷酸缓冲盐溶液(PBS)，购自武汉巴菲尔生物技术服务有限公司；苏木精-伊红(HE)染色试剂盒，购自上海晶都生物技术有限公司；蛋白裂解液(RIPA)、苯甲基磺酰(PMSF)，购自艾美捷科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量试剂盒、聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶试剂盒，购自北京纽朴生物技术有限公司；兔抗磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)、磷酸化丝裂原活化蛋白激酶p38(p-p38)单克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG，均购自上海恒斐生物科技有限公司。

1.1.3 实验设备 Deltaphase®小动物恒温手术台，美国Braintree公司产品；PS-MVG-RT型小动物呼吸机，美国Kent公司产品；vevo®2100小动物超声影像平台，加拿大Visual Sonics公司产品；TB-215D型电子天平，美国DENVER公司产品；UNIVERSAL 320(R)型离心机，德国Hettich公司产品；DSZ-70PHC型光学显微镜，日本Carton公司产品；Power Pac 300型电泳仪，美国Bio-Rad公司产品；Biodoc-IT型凝胶成像系统，美国UVP公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 造模及给药方法 经过1周适应性饲养后，给大鼠编号并随机分为对照组(13只)及造模组(65只)。所有大鼠称重后，采用10%水合氯醛0.03 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，麻醉充分后将大鼠仰卧位固定于小动物恒温手术台上(36 ℃)，颈前常规备皮、消毒，行气管插管，连接小动物呼吸机；胸前备皮、消毒、铺巾，于胸骨旁左侧2～3 cm作纵向切口，逐层切开，自胸骨左侧2肋和第3肋间打开胸腔，暴露主动脉弓；造模组以22G垫扎针和5号非吸收性缝合线结扎主动脉弓，结扎位置为头臂动脉和左颈总动脉之间，使主动脉弓缩窄70%，对照组不结扎主动脉弓；检查无活动性出血后，逐层关闭缝合伤口，待大鼠完全恢复自主呼吸时撤除气管插管；术后给予青霉素20×104U腹腔注射，每日1次，连续3 d。术后7 d，采用vevo®2100小动物超声影像平台测定大鼠双侧颈总动脉血流速度，左右颈总动脉血流速度差>5倍即判断为心肌肥厚模型建立成功。造模过程中若大鼠意外死亡或建立模型失败及时进行补充[6]。

将造模成功的大鼠随机分为模型组、缬沙坦组及低浓度川芎嗪组、中浓度川芎嗪组、高浓度川芎嗪组，各13只。模型组及对照组分别给予蒸馏水5 mL/kg灌胃，每日1次；缬沙坦组给予2 mg/mL缬沙坦溶液5 mL/kg灌胃，每日1次；低浓度川芎嗪组、中浓度川芎嗪组、高浓度川芎嗪组分别给予5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL的川芎嗪溶液5 mL/kg灌胃，每日1次。各组大鼠干预时间均为8周。

1.2.2 大鼠心脏彩超检查 末次给药次日，称取体质量(BW)，采用10%水合氯醛0.03 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，胸前常规备皮，采用vevo®2100小动物超声影像平台观察大鼠超声心动图，测定左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(FS)、左室后壁厚度(LVWT)、室间隔厚度(IVS)。

1.2.3 标本采集与处理 心脏彩超检查结束后，打开胸腔，小心取出完整心脏，采用PBS洗去残留血液，滤纸吸干残余液体，称取全心质量(HW)；将心脏置于冰上，切取左心室和室间隔，称取左心室质量(LVM)。取1/2左心室和室间隔组织，置于10%多聚甲醛溶液中固定48 h，经梯度浓度乙醇处理脱水、二甲苯溶液处理透明及石蜡包埋后，切片厚度为5 μm；其余1/2左心室和室间隔组织置于液氮内速冻，于-70 ℃冰箱保存用于后续蛋白质免疫印迹(Western Blotting)测定[7]。

1.2.4 心脏质量指数及左心室质量指数计算 计算公式为：心脏质量指数(HMI)=HW/BW；左心室质量指数(LVMI)=LVM/BW。

1.2.5 HE染色观察心肌肥厚程度 取1.2.3中制备的心肌组织切片→置于30%乙醇中漂浮展片→置于45～50 ℃温水中二次漂浮展片→苏木素溶液染色15 min→蒸馏水漂洗→伊红溶液染色3 min→蒸馏水漂洗→80%、95%、95%、100%、100%乙醇分别处理3 min脱水→二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液分别处理3 min→中性树胶封固→晾干[8]。

每张切片随机选取3个不连续视野，采用光学显微镜于40×10倍镜下观察染色情况并拍照，之后使用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统软件测定心肌纤维横径，并取平均值。

1.2.6 Western Blotting检测大鼠心肌组织p-ERK、p-p38蛋白表达水平 取1.2.3中冻存的心肌组织，在液氮中研碎→加入4 ℃ RIPA缓冲液3 mL/g+10 mg/mL PMSF 30 μL/g，并充分匀浆→采用10 mg/mL PMSF 30 μL/g于冰上处理30 min→4 ℃条件下以15 000 r/min离心15 min获得细胞裂解液→使用BCA法测定总蛋白浓度→按照试剂盒说明制备12%SDS-PAGE凝胶，并固定于电泳仪上→取含有50 μg蛋白的总蛋白样品→加入等体积2×上样缓冲液→置于沸水中3 min使蛋白变性→上样→电泳(浓缩胶70 V、30 min，分离胶110 V、180 min)分离目的蛋白→蛋白转移至硝酸纤维素膜上→丽春红染液中染色8 min→室温条件下使用封闭液摇床封闭硝酸纤维素膜120 min→TBST洗涤10 min，3次→4 ℃条件下，1︰500稀释的p-ERK、p-p38、β-actin(内参)单克隆抗体分别摇床孵育16 h→TBST洗涤10 min，3次→室温下，1︰1 000稀释的HRP标记山羊抗兔IgG二抗摇床孵育35 min→TBST洗涤10 min，3次→采用化学发光试剂盒曝光、显影、定影[9]。采用Biodoc-IT型凝胶成像系统测定目的蛋白条带光密度值，并计算p-ERK、p-p38蛋白β-actin相对表达量。

2 结 果

2.1 各组大鼠超声心动图指标比较 与对照组比较，模型组、缬沙坦组及低浓度川芎嗪组、中浓度川芎嗪组、高浓度川芎嗪组大鼠LVEF、FS降低，LVWT、IVS升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，低浓度川芎嗪组、中浓度川芎嗪组、高浓度川芎嗪组及缬沙坦组LVEF、FS均升高，且低浓度川芎嗪组<中浓度川芎嗪组<高浓度川芎嗪组和缬沙坦组，差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，低浓度川芎嗪组、中浓度川芎嗪组、高浓度川芎嗪组及缬沙坦组大鼠LVWT、IVS降低，且低浓度川芎嗪组>中浓度川芎嗪组>高浓度川芎嗪组和缬沙坦组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠超声心动图指标比较(±s)

2.2 各组大鼠HMI、LVMI比较 与对照组比较，模型组、缬沙坦组及低浓度川芎嗪组、中浓度川芎嗪组、高浓度川芎嗪组大鼠HMI、LVMI升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，低浓度川芎嗪组、中浓度川芎嗪组、高浓度川芎嗪组及缬沙坦组大鼠HMI、LVMI降低，且低浓度川芎嗪组>中浓度川芎嗪组>高浓度川芎嗪组和缬沙坦组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠HMI、LVMI比较(±s) 单位：mg/g

2.3 各组大鼠心肌纤维横径比较 HE染色结果显示：对照组大鼠心肌细胞大小、形态正常，模型组大鼠心肌纤维横径较对照组明显增粗，低浓度川芎嗪组、中浓度川芎嗪组、高浓度川芎嗪组及缬沙坦组大鼠心肌纤维横径较对照组增粗，较模型组均有不同程度改善。详见图1。与对照组比较，模型组、缬沙坦组及低浓度川芎嗪组、中浓度川芎嗪组、高浓度川芎嗪组大鼠心肌纤维横径增粗，差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，低浓度川芎嗪组、中浓度川芎嗪组、高浓度川芎嗪组及缬沙坦组大鼠心肌纤维横径缩短，且低浓度川芎嗪组>中浓度川芎嗪组>高浓度川芎嗪组和缬沙坦组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

图1 各组大鼠心肌纤维横径观察结果(HE染色，400×)

表3 各组大鼠心肌纤维横径比较(±s) 单位：μm

2.4 各组大鼠心肌组织p-ERK、p-p38蛋白表达水平比较 与对照组比较，模型组、缬沙坦组及低浓度川芎嗪组、中浓度川芎嗪组、高浓度川芎嗪组大鼠心肌组织p-ERK蛋白表达水平升高，p-p38蛋白表达水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，低浓度川芎嗪组、中浓度川芎嗪组、高浓度川芎嗪组及缬沙坦组大鼠心肌组织p-ERK蛋白表达水平降低，且低浓度川芎嗪组>中浓度川芎嗪组>高浓度川芎嗪组和缬沙坦组，差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，低浓度川芎嗪组、中浓度川芎嗪组、高浓度川芎嗪组及缬沙坦组大鼠心肌组织p-p38蛋白表达水平增高，且低浓度川芎嗪组<中浓度川芎嗪组<高浓度川芎嗪组和缬沙坦组川芎嗪组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表4及图2。

表4 各组大鼠心肌组织p-ERK、p-p38蛋白表达水平比较(±s)

A为对照组；B为模型组；C为低浓度川芎嗪组；D为 中浓度川芎嗪组；E为高浓度川芎嗪组；F为缬沙坦组。图2 Western Blotting检测各组大鼠 心肌组织p-ERK、p-p38蛋白表达

3 讨 论

心肌肥厚是多种心血管疾病的共同病理过程。吴小龙等[10]研究认为，压力负荷和容量负荷是该病常见和重要的诱因，其发病过程受肾素-血管紧张素-醛固酮系统、交感神经系统、内皮素、一氧化氮等神经体液因素以及转化生长因子-β、胰岛素生长因子1、成纤维细胞生长因子等多种细胞因子和环加氧酶、钙调神经磷酸酶等多种因素影响。近年来，随着分子生物学技术发展，关于心肌肥厚发病机制的研究已深入至细胞、分子层面，细胞内信号转导异常在心肌肥厚发病中的作用越来越受到关注。

MAPK是真核细胞中重要信号转导通路，主要包括细胞外调节蛋白激酶(ERK)、p38-MAPK、C-Jun N端激酶(JNK)3种途径，其中ERK参与心肌正常发育和生理代偿性肥大，p38调节病理性心肌肥厚[11-12]，二者在心肌肥厚发生中的作用均已得到证实。周亚光等[13]研究发现，调节MAPK通路蛋白可抑制心肌肥厚。本研究从信号转导系统MAPK通路的影响方面探讨川芎嗪对压力超负荷诱导大鼠心肌肥厚的干预效果及作用机制。

川芎嗪为中药川芎的活性成分，川芎为血中之气药，具有活血化瘀、行气止痛之效，在心脑血管疾病的治疗中应用广泛。川芎嗪作为川芎的有效成分，具有保护心脑血管作用，有研究显示，其具有抗肿瘤、镇静镇痛、抗血栓、抗缺血再灌注损伤、抗氧化、抗凋亡、抑制心肌收缩及保护血管内皮、肾脏、肝脏、肺等药理作用[14]。余良主等[15]研究发现，川芎嗪通过抑制核因子-κB信号通路，抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大。潘勇军等[16]研究发现，川芎嗪下调蛋白激酶B信号转导系统相关蛋白的表达，从而发挥抑制左室肥厚的作用。川芎嗪通过多种途径抑制心肌肥厚，但具体作用机制尚未完全明确。

本研究采用主动脉弓缩窄法建立大鼠压力超负荷性心肌肥厚模型，经不同浓度的川芎嗪及缬沙坦干预后发现，与模型组比较，低浓度川芎嗪组、中浓度川芎嗪组、高浓度川芎嗪组和缬沙坦组大鼠LVEF、FS升高，LVWT、IVS、HMI、LVMI降低，心肌纤维横径缩短，差异均有统计学意义(P<0.05)，且以高浓度川芎嗪组作用最明显；早期发生心肌肥厚属于代偿性，可增加心排血量，但随着疾病进展，LVWT、IVS、HMI、LVMI均不断升高，出现过度心肌肥厚，导致心肌收缩功能下降，泵血功能减弱[17]，LVEF、FS随之下降，并最终发展为心力衰竭。本研究结果表明，川芎嗪能有效抑制心肌肥厚发展，改善相关心脏功能，且药物浓度越高作用效果越好。

MAPKs信号转导系统中的ERK、p38通路在压力超负荷性心肌肥厚发生发展过程中发挥重要作用。ERK为细胞外信号调节激酶，主要传导生长因子刺激信号，其被磷酸化激活后转位进入细胞核，活化下游的c-fos、p53、转录因子GATA结合蛋白4等，并调控相关基因，加速心肌细胞生长、繁殖，导致心肌肥厚[18]，抑制p-ERK可减轻生理代偿性心肌肥厚；p38 MAPK属于应激活化蛋白激酶亚家族成员，是高度保守的应激信号通路，可被白细胞介素-1、渗透压、热休克等细胞应激激活，生成的p-p38可抑制核转录，同时影响肿瘤坏死因子、Fas/FasL等下游相关基因激活，抑制病理性心肌肥厚[19]，起到心肌保护作用。本研究结果显示，与模型组比较，低浓度川芎嗪组、中浓度川芎嗪组、高浓度川芎嗪组及缬沙坦组大鼠心肌组织p-ERK蛋白表达水平降低，p-p38蛋白表达水平升高，且高浓度川芎嗪组和缬沙坦组表达水平最低，表明川芎嗪可剂量依赖性抑制ERK蛋白激活，促进p-p38蛋白激活，调控MAPKs信号转导系统活性，这可能是川芎嗪抗压力超负荷性心肌肥厚的作用机制之一。

综上所述，川芎嗪可剂量依赖性改善压力超负荷性心肌肥厚大鼠心脏功能，抑制心肌肥厚，其作用可能与调节MAPK信号转导通路中ERK、p38蛋白表达有关。