居励之，林赟霄，吴 琼，曹 敏，彭珑萍，董艺丹，张成辉，施锦绣，王佑华
老龄化已经成为当今社会的严峻问题[1]，而原发性高血压病严重威胁我国老年人群的身体健康[2]。高脂血症是心血管疾病的重要危险因素之一，研究发现，高血压病和高脂血症往往互相影响、互相伴随[3]。载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)是人体中重要的载脂蛋白[4]，其基因多态性及高脂血症与老年人血压密切相关[5-6]。证候是疾病过程中某一阶段或某一类型的病理概括，近年来，有学者开展了大量基因型与中医证候相关性的研究，但基因型与中医证型及临床表型之间联合分析的研究尚待深入。本课题组研究上海市某社区高血压病人群，发现 rs1800871基因多态性与老年高血压中医证型相关，与老年男性高血压病虚实辨证相关[6]。本研究拟运用二代测序技术检测ApoE基因，探讨ApoE基因型与老年男性高血压病病人中医证型及血脂的相关性，探索高血压病病人中医证型与血脂表型的遗传基础，寻找诊断评估的新切入点，以期为临床辨治高血压病提供新的思路。
1 资料与方法
1.1 研究对象 选取2016年—2017年在上海某社区体检的老年男性高血压病病人284例，年龄65～85(73.84±5.70)岁，其中肾气亏虚证53例，肝火亢盛证87例，痰瘀互结证67例，阴虚阳亢证78例。
1.2 病例选择标准
1.2.1 诊断标准 参照《中国高血压防治指南》修订委员会制定的《中国高血压防治指南(2010年修订版)》[7]及《中国成人血脂异常防治指南制定联合委员会》制定的《中国成人血脂异常防治指南(2016年修订版)》[8]高血压及血脂异常标准。中医证候标准参照《眩晕(原发性高血压)中医诊疗方案》(国家中医药管理局高血压国家中医临床基地)及《中药新药临床研究指导原则》(国家药品监督管理局)[9]分为肝火亢盛型、痰瘀互结型、阴虚阳亢型、肾气亏虚型。
1.2.2 纳入与排除标准 纳入标准：符合高血压病、血脂异常西医诊断标准及中医证候标准；年龄≥65岁，男性；合并糖尿病、心脏病及心脑血管病者。排除标准：继发性高血压者；继发性血脂异常者；合并严重肝、肾、呼吸及精神病者；合并肿瘤、自身免疫性疾病、妊娠及哺乳期妇女。
1.3 观察指标
1.3.1 资料与样本采集 收集病人年龄、身高、体重、体质指数(BMI)、血压、既往史、用药史、家族史等资料，由两名主治医师及以上医生共同对病人进行中医辨证分型。留取病人清晨空腹静脉血，用于提取DNA进行ApoE基因二代测序。
1.3.2 DNA提取 根据QLAGENFlexiGene DNA试剂盒提取全血DNA，测定浓度后于-20 ℃保存。
1.3.3 ApoE基因二代测序 运用Illumina MiSeq进行二代测序。ApoE引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计。靶区域PCR扩增：Primer Pool Mix 5μL，gDNA 3 μL，ddH2O 7 μL，2XM_Enzyme MIX 15 μL(95 ℃ 3 min；98 ℃ 15 s，60 ℃ 4 min 18个循环；10 ℃ +∞)。扩增产物纯化后导入测序接头：2XM_Enzyme MIX 10 μL，DNA(上阶段产物)8 μL，2PCRprimer F 0.25 μL，2Barcodeprimer R 0.5 μL，ddH2O 1.25 Ml(95 ℃ 3 min；98 ℃ 15 s，60 ℃ 4 min，18个循环；10 ℃ +∞)。产物进行两轮纯化回收后，采用llumina MiSeq测序仪进行测序。
2 结 果
2.1 各证型老年男性高血压病病人基线资料比较 老年男性高血压病病人中，肝火亢盛组年龄(73.84±5.70)岁；阴虚阳亢组年龄(75.34±5.77)岁；痰瘀互结组年龄(76.5±6.63)岁；肾气亏虚组年龄(74.14±6.35)岁。4种证型间病人年龄分布比较差异有统计学意义(P<0.05)，各证型间两两组间比较，校正P值后发现，年龄在肝火亢盛证与痰瘀互结证之间分布差异有统计学意义(P<0.008)。4种证型病人病程、吸烟、饮酒、BMI、空腹血糖(FBG)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。
表1 4种证型老年男性高血压病病人基线资料比较
2.2 ApoE突变位点基因型的检测结果 本研究共检测到3个突变频率较高的位点，包括rs769449、rs429358、rs7412，其突变频率分别为13.38%、14.79%、13.03%。4个位点均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。
2.3 各基因型在4种中医证型间的分布 rs769449、rs429358、rs7412基因型在老年高血压病病人4种中医证型的分布比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。
表2 各基因型在4种中医证型间的分布 单位：例
2.4 各证型间不同基因型、血脂水平分析
2.4.1 肝火亢盛证 在肝火亢盛证中，rs769449、rs429358基因型间TG、TC、LDL-C和HDL-C的水平相似，差异无统计学意义(P>0.05)。rs7412基因型间TC的水平相似，而在TG、LDL-C、HDL-C水平方面差异有统计学意义(P<0.05)，即在老年高血压病肝火亢盛证中，rs7412 CC型具有较低的TG、LDL-C的水平和较高的HDL-C水平。详见表3。
2.4.2 阴虚阳亢证 在阴虚阳亢证中，rs769449基因型间TG的水平相似，在TC、LDL-C和HDL-C水平的差异有统计学意义(P<0.05)，即在老年高血压病阴虚阳亢证中，rs769449 GG型具有较低的TC、LDL-C、HDL-C水平。rs429358基因型间TG、TC和LDL-C的水平相似，在HDL-C水平差异有统计学意义(P<0.05)，即在老年男性高血压病阴虚阳亢证中，rs429358 TT型具有低水平HDL-C。rs7412基因型间TG、TC、LDL-C和HDL-C的水平相似，差异均无统计学意义(均P>0.05)。详见表3。
2.4.3 痰瘀互结证 在痰瘀互结证中，rs769449、rs7412基因型间TG、TC、LDL-C和HDL-C的水平相似，差异无统计学意义(P>0.05)。rs429358基因型间TG和HDL-C的水平相似，在TC和LDL-C水平的差异有统计学意义(P<0.05)，即在老年男性高血压病痰瘀互结证中，rs429358 TT型TC、LDL-C的水平较高。详见表3。
2.4.4 肾气亏虚证 在肾气亏虚证中，rs769449、rs429358、rs7412基因型间TG、TC、LDL-C和HDL-C的水平相似，差异均无统计学意义(均P>0.05)。详见表3。
表3 4种证型不同基因型血脂水平比较 (±s) 单位：mmol/L
TT型比较，③P<0.05；与痰瘀互结型rs429358 TT型比较，④P<0.05。
3 讨 论
原发性高血压病是由环境、个体差异和基因等诸多因素互相作用而导致的，其中有30%～50%的个体高血压风险归因于遗传因素[10]。血脂异常是高血压病独立的危险因素之一，我国35岁以上人群约有2 500万人同时患有高血压病和高脂血症，两者间相互影响、相互促进[11]。ApoE是一个由299个氨基酸组成的磷脂糖蛋白，分子量为34 kD，其基因位于19号染色体的长臂，有显着的遗传多态性。ApoE多态性与高血压及血脂异常之间存在关联[5，12]。
证候是疾病过程中某一阶段或某一类型的病理概括，是机体内因和环境外因综合作用的反应状态， 可随着病程的发展而发生相应变化[13]，但在一些慢性病病人中，临床常观察到中医证型和临床表型的相对稳定姓。从现代医学角度而言，疾病发生过程是相关基因与内外环境相互作用的结果，表现为多基因复杂性和动态演变过程，这与中医学以证候概括发病过程的方法有相似之处，基因作为遗传的物质基础，可能是证候形成的主要原因之一[14-15]。近年来，学者们开展了大量基因分型与中医证候相关性的研究，但ApoE基因型与高血压中医证型及血脂之间相关性研究鲜见报道。
在中医学古籍文献中虽无“高血压病”病名的记载，但根据其症状、演变及并发症，可将其归属到中医学“眩晕”“头痛”等疾病的范围。本研究将高血压病分为4个证型，即肝火亢盛证、阴虚阳亢证、痰瘀互结证、肾气亏虚证。本研究调查发现，上海某社区老年男性高血压病病人占比最多的是肝火亢盛证，这种分布情况与现代医家对高血压病的认识大体一致。其中痰瘀互结证年龄高于肝火亢盛证，差异有统计学意义(P<0.008)，考虑年老体虚，正气不足，脏腑衰弱气机不畅，更易出现痰瘀。运用Illumina Miseq共检测到22个ApoE基因突变位点，均符合Hardy-Weinberg平衡，其中rs769449、rs429358、rs7412突变率分别为13.38%、14.79%、13.03%。rs769449、rs429358、rs7412基因型在老年男性高血压中医证型分布比较差异无统计学意义(P>0.05)。在肝火亢盛证中，rs7412基因 CC型具有较低的TG、LDL-C的水平和较高的HDL-C的水平(P<0.05)。在阴虚阳亢证中，rs769449 GG型具有较低的TC、LDL-C、HDL-C水平(P<0.05)。rs429358 TT型具有低水平的HDL-C(P<0.05)。在痰瘀互结证中， rs429358 TT型TC、LDL-C的水平较高(P<0.05)。
在老年男性高血压病病人中，rs7412 CC型是肝火亢盛证血脂异常的保护因素，rs769449 GG型是阴虚阳亢证血脂异常的保护因素，rs429358 TT型是阴虚阳亢证及痰瘀互结证血脂异常的危险因素。由于高血压病是一种由多因素综合影响导致的复杂疾病，其证型受年龄、地域、气候、环境等因素影响，并且高血压病易感性基因较多，机制尚未完全阐明清楚。本课题对ApoE基因型与中医证型及血脂的相关性研究，受研究地域及年龄层次、样本数等限制，仍需进一步深入探索。
