白冬阳，张丽华

随着我国人口老龄化越来越严重，心血管疾病逐渐成为高发疾病，心力衰竭受多种原因影响，导致心脏功能发生病变，病人主要的临床症状是心室重构、心律失常、射血分数不足等[1]。相关研究显示，心力衰竭病人在确诊后5年生存率低于40%[2]，因此，采用有效的药物治疗心力衰竭对病人具有重要意义。心肌细胞凋亡是由于心力衰竭病人左室功能不断恶化的结果，Wang等[3]研究指出，细胞凋亡在心力衰竭发病中具有重要作用，通过对心肌细胞凋亡进行抑制能减少心肌重构、心力衰竭。丹参微寒、味苦，丹参提取物主要有效成分丹参酮ⅡA属于一种脂溶性成分，具有一定的活性，在心脑血管疾病治疗中具有重要作用，其主要功效是清热安神、活血化瘀、行经止痛[4-5]。本研究旨在探讨丹参提取物对心力衰竭模型大鼠的干预效果及对心肌细胞凋亡的影响，为丹参提取物临床应用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 实验动物 选取Wistar雄性大鼠50只，6～10月龄，体质量220～260 g，均由江西中医药大学基础医学部提供，许可证号：SCXK(赣)2014-016。所有大鼠在温度(22±2)℃、湿度55%环境中喂养1周。本实验获得我院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 模型建立 选取50只大鼠建立心力衰竭模型，参考童静等[6]文献，采用腹腔注射阿霉素的方法建立慢性心力衰竭大鼠模型，将阿霉素配制成2 mg/mL的溶液连续6周腹腔注射(4 mg/kg)，使用10%水合氯醛腹腔注射进行麻醉处理，之后将大鼠仰卧在操作台上，固定，剃除大鼠胸前区毛发，测定心脏左心射血分数，当左心射血分数<60%时则表示心力衰竭大鼠模型建立成功。选取其中10只大鼠作为假手术组，只分离腹主动脉，给予不完全结扎。

1.2.2 丹参提取物制备及分组 将丹参置于75%的10倍质量乙醇中，浸泡时间为1 h，流提取时间设置为30 min，需要重复3次，过滤，得到提取液。通过减压干燥处理后得到浸膏，蒸馏水连续洗涤5次，通过喷雾干燥得到固态的丹参提取物，其中丹参酮含量为93.8%。使用生理盐水配制丹参提取物混悬液，浓度为0.15 g/mL。参考汪德坤等[7]文献，将40只建模成功的大鼠随机分为模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，各10只。低剂量组、中剂量组、高剂量组分别给予0.1 mL/kg丹参提取物混悬液、0.3 mL/kg丹参提取物混悬液、0.5 mL/kg丹参提取物混悬液腹腔注射，模型组和假手术组给予等体积的氯化钠注射液腹腔注射，每周1次，连续干预6周。所有大鼠在干预过程中均自由饮食，无大鼠死亡。

1.2.3 心功能相关指标检测 采用四道生物机能实验系统记录仪(BL-420E)，记录大鼠动脉收缩压(systolic arterial pressure，SAP)、平均动脉压(mean arterial pressure，MAP)、心率(heart rate，HR)、左心室收缩压(left ventricular systolic pressure，LVSP)。

1.2.4 心肌病理组织染色 大鼠断头处死后，快速提取大鼠心肌组织，在4%多聚甲醛溶液中固定，经过乙醇脱水处理，石蜡包埋，在切片机中进行连续切片，脱蜡、二甲苯透明，给予苏木素-伊红(HE)染色。

1.2.5 心肌细胞凋亡检测 心肌组织染色后采用CMIAS-Ⅱ图像分析仪，选择10×10倍视野，每张切片随机选择5个视野，不重复计数100个心肌细胞。评估标准：在细胞核中出现棕黄色颗粒表示凋亡细胞。心肌细胞凋亡率=凋亡阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.2.6 ColⅠ、ColⅢ、p53、磷酸化细胞外调节蛋白激酶(p-ERK)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)蛋白表达 采用蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测，将采集到的标本以10 000 g离心处理10 min，取出上清液，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白定量，将50 μg蛋白加入2×SDS凝胶加样缓冲液中，100 ℃加热处理5 min促使蛋白变性。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳完成后进行转膜，结束后取下硝酸纤维素膜，在5%脱脂牛奶中4 ℃下封闭1 h，封闭结束后，加一抗使用0.05%～0.10%TBST稀释(ColⅠ、ColⅢ、p53、p-ERK、p-JNK一抗为1∶1 000)，4 ℃孵育过夜保存，之后使用0.05%～0.10% TBST洗膜3次，每次5 min，加二抗使用0.05%～0.10% TBST给予稀释(1∶10 000)，室温摇动孵育1 h，最后使用0.05%～0.10%TBST洗膜3次，每次5 min。采用DAB染色试剂盒显色，光密度扫描后进行定量分析。以甘油醛-3-磷酸脱氢酸(GAPDH)为内参。

2 结 果

2.1 丹参提取物对心力衰竭模型大鼠心功能相关指标的影响 与模型组相比，假手术组、低剂量组、中剂量组、高剂量组HR、LVSP、SAP、MAP水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。与假手术组相比，低剂量组、高剂量组HR、LVSP、SAP、MAP水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。假手术组与中剂量组HR、LVSP、SAP、MAP水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。高剂量组、低剂量组HR、LVSP、SAP、MAP水平低于中剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠心功能相关指标比较 (±s)

2.2 丹参提取物对心力衰竭模型大鼠心肌病理组织的影响 假手术组心肌细胞正常，纹理表现清晰，未发现心肌细胞坏死、纤维增生。模型组发现心肌细胞显示片状坏死，透壁性增加，大部分心肌细胞发生溶解，心肌纤维显示为波浪状，发生空泡变性，间质产生纤维化。高剂量组、低剂量组未发现心肌细胞片状坏死，小灶性和条索状坏死与存活心肌之间产生交错。中剂量组变性、纤维化发生轻微的改变。详见图1。

图1 各组大鼠心肌病理组织(HE染色，×100)

2.3 丹参提取物对心力衰竭模型大鼠ColⅠ、ColⅢ蛋白表达水平的影响 与模型组相比，假手术组、低剂量组、中剂量组、高剂量组ColⅠ、ColⅢ蛋白表达水平均降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。与假手术组相比，低剂量组、高剂量组ColⅠ、ColⅢ蛋白表达水平均升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。假手术组与中剂量组ColⅠ、ColⅢ蛋白表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。高剂量组、低剂量组ColⅠ、ColⅢ蛋白表达水平高于中剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2、图2。

表2 各组大鼠ColⅠ、ColⅢ蛋白表达水平比较(±s) 单位：ng/mL

图2 各组大鼠ColⅠ、ColⅢ蛋白表达

2.4 丹参提取物对心力衰竭模型大鼠心肌细胞凋亡的影响 与模型组相比，假手术组、低剂量组、中剂量组、高剂量组心肌细胞凋亡率降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。与假手术组相比，低剂量组、高剂量组心肌细胞凋亡率升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。假手术组与中剂量组心肌细胞凋亡率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。高剂量组、低剂量组心肌细胞凋亡率高于中剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠心肌细胞凋亡率比较(±s) 单位：%

2.5 丹参提取物对心力衰竭模型大鼠p53、p-ERK、p-JNK蛋白表达的影响 与模型组相比，假手术组、低剂量组、中剂量组、高剂量组p-ERK、p-JNK蛋白表达水平均降低，假手术组、中剂量组p53水平均降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。与假手术组相比，低剂量组、高剂量组p53、p-ERK、p-JNK蛋白表达水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。假手术组与中剂量组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。高剂量组、低剂量组p53、p-ERK、p-JNK蛋白表达水平高于中剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表4、图3。

表4 各组大鼠p53、p-ERK、p-JNK蛋白表达水平比较(±s)

图3 各组大鼠p53、p-ERK、p-JNK蛋白表达

3 讨 论

心力衰竭属于一种综合症状，主要是由病人心脏结构、功能性疾病引发射血能力、心室充盈受损，主要发生在各种心脏疾病终末阶段，心力衰竭病理变化体现在心室舒缩功能障碍[8]。大量研究显示，心力衰竭会造成外周、心脏发生供血异常，一旦到失代偿期会发生不良后果，严重者会导致不良事件发生[9]。丹参主要用于活血化瘀等方面治疗，在心肌梗死、冠心病、心绞痛等心血管疾病治疗中具有重要作用[10]。

MAP能有效地反映心泵功能，在病人心血管危险性评估中发挥着重要信号作用，在病人预后评估中也具有重要意义[11]。本研究结果显示，模型组HR、LVSP、SAP、MAP水平降低，说明心力衰竭模型大鼠建模成功。丹参提取物干预后，HR、LVSP、SAP、MAP水平升高，且中剂量组HR、LVSP、SAP、MAP水平最高。说明大鼠心力衰竭特征得到改善，随着剂量的增加，对大鼠心室重构具有一定的抑制作用，中剂量对其逆转心室重构，改善心功能方面效果显着。

心肌纤维化在心力衰竭过程中发挥着重要作用，研究显示，心肌组织胶原含量提高2～3倍会引起心室充盈异常，心室顺应性降低，当提高到4倍会引起心脏射血分数异常[12-13]。本研究结果显示，模型组心肌细胞出现片状坏死，心肌细胞溶解，发生心肌纤维化，与叶小汉等[14]研究结果一致。丹参提取物干预后心肌细胞纤维化得到改善，其中中剂量组改善效果最为显着。提示丹参提取物能减轻心力衰竭大鼠心肌细胞损伤。心力衰竭发病左室功能随之恶化，心肌细胞凋亡发生，导致心肌细胞数量随之减少，引起心肌细胞肥大，纤维化不断增生，其中心肌细胞凋亡是导致心力衰竭的重要原因[15]。相关研究显示，心肌细胞凋亡属于一个复杂过程，受多种蛋白的调控。本研究结果显示，丹参提取物干预组心肌细胞凋亡率降低，且中剂量效果突出。沈启明等[16]研究指出，心复力颗粒能降低阿霉素致扩张型心肌病心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡率，与本研究结果一致，提示丹参提取物与心复力颗粒疗效一致。

p53在细胞中作为一种反应中介，属于一种核转录因子对下游的基因表达起到调控作用，参与细胞凋亡过程，通过消除基因，促进细胞性质改变。邱伯雍等[17]研究指出，p53表达提高会诱导心肌细胞发生凋亡。ERK在细胞凋亡过程中发挥着重要作用，可以通过不同机制参与细胞凋亡过程，ERK通过上调p53表达，维持蛋白活性稳定，持续活化ERK，能有效地抑制p5泛素化，提高在细胞中的含量，导致细胞凋亡发生[18-19]。Silva等[20]研究指出，JNK通过增强转录因子复合物AP-1活性，提高p53等促凋亡蛋白表达，参与细胞凋亡过程。本研究中，高剂量组、低剂量组、中剂量组p53、p-ERK、p-JNK蛋白表达较假手术组升高，说明丹参提取物能上调p53、p-ERK、p-JNK蛋白表达，抑制心肌细胞凋亡。

综上所述，丹参提取物能改善心力衰竭大鼠心功能，通过调控p53、p-ERK、p-JNK蛋白表达，抑制心肌细胞凋亡，为临床应用提供理论依据。