氯吡格雷通过CaMKKβ/AMPK/Nrf2通路抑制TNF-α诱导的VCAM-1表达保护内皮细胞

贾菲 朱艺欣 王艺臻

摘要 目的：探讨单磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）和血红素加氧酶1（HO-1）在氯吡格雷（INN）抑制肿瘤坏死因子-α（TNF-α）刺激的血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）表达中的作用及机制。方法：①内皮细胞（ECs）用INN预处理24 h或N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）预处理2 h，并用2，7-二氯荧光素二乙酸酯（H2DCFDA）处理15 min，然后再用TNF-α处理20 min，测定活性氧（ROS）水平。②将ECs与INN孵育指定的时间点，蛋白质免疫印迹法（Western Blotting）和实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）检测HO-1蛋白、mRNA表达，测量HO-1活性。 将转染shHO-1的ECs与INN孵育24 h，再用TNF-α刺激6 h。在有或没有INN的情况下，将ECs与TNF-β孵育8 h，进行黏附测定。③将ECs与INN孵育不同的时间，对总蛋白进行磷酸化-AMPK（p-AMPK）和AMPK表达Western Blotting分析。 ECs用STO-609和化合物C（一种AMPK抑制剂）处理1 h，与INN一起孵育16 h。检测HO-1蛋白、mRNA表达，测量HO-1活性。 ECs用STO-609和化合物C处理1 h，然后与INN一起孵育24 h，检测谷胱甘肽（GSH）含量。④ECs用化合物C处理1 h，然后与INN孵育指定的时间，检测核因子-E2相关因子2（Nrf2）蛋白表达。用shLuc或shNrf2转染ECs，用10 μmol/L INN处理16 h，检测HO-1蛋白、mRNA表达。⑤用TNF-α处理ECs，使用或不使用二甲基亚砜（DMSO）（空白载体），INN，或INN＋化合物C进行VCAM-1、p-AMPK和AMPK表达测量。在有或没有INN的情况下，将用shLuc或shNrf2转染的EC与TNF-α孵育8 h，检测VCAM-1表达。结果：INN减少了TNF-α诱导的ROS产生，并在时间上提示HO-1的表达和活性。 INN增加了细胞GSH水平。shHO-1阻断了INN对TNF-α诱导的HL-60细胞黏附的抑制作用。钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶β（CaMKKβ）/AMPK通路和Nrf2转录因子与INN诱导HO-1有关。另外，TNF-α明显增加了VCAM-1蛋白和mRNA的表达。INN处理显着抑制TNF-α诱导的VCAM-1表达和HL-60细胞黏附。化合物C和shNrf2消除了TNF-α诱导的VCAM-1表达和HL-60细胞黏附。结论：氯吡格雷通过CaMKKβ/AMPK/Nrf2途径抑制TNF-α诱导的VCAM-1表达进而保护内皮细胞。

关键词 氯吡格雷；钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶β/腺苷酸激活蛋白激酶/核因子E2相关因子2通路；肿瘤坏死因子-α；血管细胞黏附分子-1；内皮细胞；实验研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.02.012

Effect of Clopidogrel on Endothelium by Hindering TNF-α Induced VCAM-1 Expression through CaMKKβ/AMPK/Nrf2 Pathway

JIA Fei， ZHU Yixin， WANG Yizhen

Affiliated Hospital of Yan′an University， Yan′an 716000， Shaanxi， China

Corresponding Author WANG Yizhen， E-mail： wang23pharmacy@aliyun.com

Abstract Objective To elucidate the role of AMP-activated protein kinase（AMPK） and heme oxygenase 1（HO-1） in the clopidogrel（INN） inhibition of tumor necrosis factor（TNF-α）-stimulated expression of vascular cell adhesion molecule 1（VCAM-1）.Methods：①ECs（endothelium cells） were pretreated with INN for 24 h or N-acetyl-L-cysteine（NAC） for 2 h，and treated with H2DCFDA for 15 min prior to being challenged with TNF-α for another 20 min.ROS levels were assayed.②ECs were incubated with INN for the indicated time points.Western blotting and reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR） were used to analyze HO-1 protein and mRNA expression.HO-1 activity was measured.ECs transfected with shHO-1 were incubated with INN for 24 h prior to being stimulated with TNF-α for additional 6 h.ECs were incubated with TNF-α in the presence or absence of INN for 8 h.Adhesion assay was performed.③ECs were incubated with INN for various time periods.Total protein was subjected to Western analysis for p-AMPK and AMPK expression.ECs were treated with STO-609 and Compound C for 1 h，followed by incubation with INN for another 16 h.HO-1 protein and mRNA expression were ananlyzed.HO-1 activity was measured.ECs were treated with STO-609 and Compound C（Comp C） for 1 h，followed by incubation with 10 μmol/L INN for another 24 h.Glutathione（GSH） content was detected.④ECs were treated with Comp C for 1 h and then incubated with INN for the indicated time，nuclear factor E2 related factor 2（Nrf2） protein expression was analyzed.ECs were transfected with shLuc or shNrf2 and treated with 10 INN for 16 h，HO-1 protein and mRNA expression were ananlyzed.⑤ECs were treated with TNF-α with or without DMSO（vehicle），INN，or INN＋Comp C for VCAM-1，p-AMPK，and AMPK expression measurement.ECs transfected with shLuc or shNrf2 were incubated with TNF-αin the presence or absence of INN for 8 h for VCAM-1 expression measurement.Results：INN reduced TNF-αinduced reactive oxygen species（ROS） generation and time-dependently prompted the expression and activity of HO-1.Cellular GSH levels were augmented by INN.shHO-1 blocked the INN suppression of TNF-α induced HL-60 cell adhesion.  The calmodulin-dependent protein kinase kinase β（CaMKKβ）/AMPK pathway and Nrf2 transcriptional factor were implicated in the induction of HO-1 by INN.Additionally，TNF-α dramatically augmented VCAM-1 expression at protein and mRNA levels.INN treatment strikingly repressed TNF-α induced expression of VCAM-1 and HL-60 cell adhesion.Compound C，an AMPK inhibitor，and shNrf2 abolished TNF-α induced expression of VCAM-1 and HL-60 cell adhesion.Conclusions：INN protects endothelium by hindering TNF-α induced VCAM-1 expression through CaMKK/AMPK/Nrf2 Pathway.

Keywords clopidogrel; calmodulin-dependent protein kinase kinase β/AMP-activated protein kinase/nuclear factor E2 related factor 2 Pathway; tumor necrosis factor-α; vascular cell adhesion molecule-1; endothelium

作者单位 延安大学附属医院（陕西延安 716000）

通讯作者 王艺臻，E-mail：wang23pharmacy@aliyun.com

引用信息 贾菲，朱艺欣，王艺臻.氯吡格雷通过CaMKKβ/AMPK/Nrf2通路抑制TNF-α诱导的VCAM-1表达保护内皮细胞［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2023，21（2）：265-271.

炎症在心血管疾病病人中很常见，在动脉粥样硬化的形成和发展中起重要作用［1］。活性氧（reactive oxygen，ROS）在炎症中起重要作用，可导致内皮氧化损伤和心血管系统功能障碍。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是机体炎症反应的重要细胞因子，能够刺激ROS的释放。血管炎症和 ROS会启动血管内皮功能障碍，这也是导致动脉粥样硬化的根本机制［2-3］。白细胞和内皮之间的复杂相互作用参与炎症反应。内皮细胞（endothelial cells，ECs）表面相对光滑且不黏附。在心血管疾病中，ECs和血液成分之间的相互作用被黏附分子例如血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）改变。研究表明，促炎分子TNF-α能够诱导细胞间黏附分子如VCAM-1表达，在动脉粥样硬化慢性炎症过程中具有关键作用［4］。血红素加氧酶1（heme oxygenase 1，HO-1）是诱导型血红素氧合酶，具有抗氧化特性［5-6］。此外，HO-1衍生的一氧化碳（CO）参与血管调节和信号转导。一些信号分子例如5′单磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）以及转录因子如核因子-E2相关因子2（nuclear factor erythroidderived 2-like 2，Nrf2），调节HO-1基因的表达［7-10］。氯吡格雷（clopidogrel，INN）是一种可阻止血液凝块的口服抗血小板药物，具有抗炎、抗氧化和抗动脉粥样硬化多种生物学特性。抗炎和抗氧化可作为预防或治疗心血管疾病的策略。本研究旨在阐明AMPK和HO-1在INN抑制TNF-α刺激的VCAM-1表达中的作用及其潜在的机制。

1 资料与方法

1.1 试剂与细胞培养 培养基199、庆大霉素、谷氨酰胺、胶原酶、明胶、胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）、青霉素和链霉素均购自Sigma。胎牛血清（FBS）、RPMI 1640培养基购自HyClone。HL-60细胞、人主动脉内皮细胞购自中国科学院上海细胞库。人TNF-α、二甲基亚砜（DMSO）、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、碳酸氢钠、化合物C和所有其他化学品均购自Sigma。通过将INN（Plavix公司）储备溶液（10 mmol/L）溶解在DMSO中来制备。 TRIzol RNA提取试剂和2，7-二氯荧光素二乙酸酯（H2DCFDA）购自Invitrogen。各抗体购自Abcam。人主动脉内皮细胞在37 ℃的199培养基中培养，该培养基中添加了20 mmol/L HEPES、2 mmol/L谷氨酰胺、20%FBS、100 mU/L青霉素和100 mg/L链霉素。每48 h刷新1次培养基，直到融合为止。在HEPES-人血清蛋白（HSA）缓冲液（10 mmol/L HEPES、10 mmol/L葡萄糖、1.5 mmol/L CaCl2、145 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、1 mmol/L MgSO4和0.25%HSA）中进行抑制剂预孵育。将化合物C和STO-609溶解在DMSO中。

1.2 蛋白质印迹法（Western Blotting） ECs在裂解缓冲液中裂解，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离等量的蛋白质样品，各取30 μg 蛋白上样，恒压进行SDS-PAGE凝胶电泳，恒流半干转至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，然后5%的封闭液室温封闭2 h，与一抗（1∶1 000）［磷酸化-AMPK（p-AMPK）、AMPK、HO-1、Nrf2、多聚ADP核糖多聚糖（PARP）和β-actin］4 ℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记二抗室温孵育2 h，以β-actin为内参，凝胶成像仪上获取图像并分析。

1.3 mRNA的提取与实时荧光定量聚合酶链式反应（realtime fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）检测mRNA表达 根据说明书用Trizol试剂盒（天根生物化学科技有限公司）提取总RNA。采用Primer 5.0软件设计荧光PCR引物，β-actin正向引物：5′-ATGTTTGAGACCTTCAACAC-3′，反向引物：5′-CACGTCACACTTCATGATGG-3′；VCAM-1正向引物：5′-CGTCTTGGTCAGCCCTTCCT-3′，反向引物：5′-ACATTCATATACTCCCGCATCCTTC-3′；HO-1正向引物：5′-GGGTGATAGAAGAGGCCAAGA3′，反向引物：5′-AGCTCCTGCAACTCCTCAAA-3′。 通过PCR扩增cDNA（1 μL）Mini OpticonTM实时PCR中的溶液（25 μL）检测系统。 循环参数设置为95 ℃、15 min，95 ℃持续15 s，58 ℃、1 min和72 ℃、1 min，40个循环。根据公式2－△△CT计算目的基因相对表达量。

1.4 HO-1活性测定 ECs裂解物中的HO-1活性计算为每小时每毫克总蛋白产生的皮摩尔胆红素，数据表示为与对照细胞相比HO-1活性的倍数。

1.5 亚细胞分级分离 根据说明书，使用亚细胞蛋白分级分离试剂盒（Thermo Fisher Scientific Inc.）进行亚细胞分离。 通过Western Blotting分析测量核级分中的Nrf2蛋白水平。 PARP的表达被用作核提取物纯度的上样对照。

1.6 shRNA的RNA干扰 选择和靶向人Nrf2和HO-1 mRNA的两个不同序列，并从Sigma（美国密苏里州圣路易斯）获得。shRNA序列如下：Nrf2 shRNA ＃1，5′-GCTCCTACTGTGATGTGAAAT-3′，shRNA ＃2，5′-CCGGCATTTCACTAAACACAA-3′； HO-1 shRNA ＃1，5′-GCTGAGTTCATGAGGAACTTT-3′，shRNA ＃2，5′-GCTGAGTTCATGAGGAACTTT-3′；shLuc shRNA，5′-CAAATCACAGAATCGTCGTAT-3′。shLuc用作载体对照。

1.7 ROS测量 如前所述，用细胞渗透性H2DCFDA测定细胞内ROS状态。 将人主动脉内皮细胞（HAEC）融合至50%融合度，然后在199培养基中补充0.5%（v/v）FBS的血清中饥饿24 h。将ECs置于不含酚红的无血清培养基中保持15 min，然后再暴露于TNF-α。ECs与H2DCFDA（10 μmol/L）孵育10 min，并在共聚焦显微镜下立即观察。

1.8 细胞谷胱甘肽（GSH）分析 将ECs用冰冷的磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤2次。在磷酸钾缓冲液（20 mmol/L，pH 7.0）中制备匀浆，并在10 000×g下于4 ℃离心20 min。保留上清液作为细胞裂解物。用二辛可宁酸（BCA）蛋白质测定试剂盒测量蛋白质。将细胞裂解液（100 μL）与5%TCA（150 μL）一起孵育，并在5 000×g下于4 ℃离心10 min。将细胞裂解物与0.4 mol/L Tris缓冲液和0.01 mol/L 二硫代双硝基苯甲酸（DTNB）一起孵育。在室温下孵育5 min后，用酶标仪在412 nm（680型，Bio-Rad）上测量细胞内GSH的含量。

1.9 统计学处理 符合正态分布的定量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析和Fisher′s 确切概率法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 INN对TNF-α诱导的HAECs ROS形成的影响 ECs用10 μmol/L INN预处理24 h或1 mmol/L N-乙酰半胱氨酸（NAC）预处理2 h，并用10 mmol/L H2DCFDA处理15 min，然后再用TNF-α（1 ng/mL）处理20 min。0.1%DMSO孵育24 h的细胞用作对照（CON）。NAC是有效的抗氧化剂，用作阳性对照。结果显示，TNF-α在20 min时促进ROS释放，而用INN预处理可显着抑制ROS释放。详见图1。

2.2 INN增强HO-1表达与活性，并阻碍TNF-α刺激的HL-60黏附 将HAECs与INN孵育不同的时间，结果显示，INN处理可以在时间上促进HO-1在mRNA和蛋白质水平及其活性上的表达（见图2）。 此外，HO-1 shRNA敲低研究确定了HO-1在INN抑制HL-60黏附中的作用。 将shHO-1转染HAECs，然后与INN一起孵育24 h，然后用TNF-α刺激HAECs再保持6 h。 通过Western Blotting证实了HO-1的敲低（见图3A）。shHO-1减轻了INN对HL-60黏附的抑制作用，即INN可通过HO-1抑制TNF-α刺激的HL-60黏附（见图3B）。2.3 钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶β（CaMKKβ）/AMPK通路介导INN诱导的HO-1表达 将ECs与INN孵育不同的时间，AMPK被INN激活（见图4）。但是，INN不会改变AMPK蛋白的表达。为了进一步证实CaMKKβ/AMPK通路的作用，使用了它们的特异性抑制剂STO-609和化合物C。STO-609和化合物C减弱了INN触发的HO-1的表达和活性（见图5）。STO-609和化合物C抑制了INN刺激的细胞中GSH含量的升高（见图6）。证明INN通过CaMKKβ/AMPK通路诱导HO-1表达并增加GSH的合成。2.4 Nrf2被INN激活并与HO-1诱导有关 为了阐明CaMKKβ/AMPK的下游信号通路对INN刺激HO-1的作用，研究了Nrf2核易位。将ECs与INN孵育指定的时间。Nrf2核易位最早在8 h后就增加了，并一直持续到INN处理后24 h为止（见图7A）。此外，Nrf2核易位在用AMPK抑制剂化合物C预处理1 h的ECs中受到抑制，然后用INN刺激。结果显示，CaMKKβ/AMPK途径与INN刺激的Nrf2核易位有关。为了进一步确定Nrf2在INN刺激的HO-1表达中的作用，用shNrf2和shLuc转染ECs。Nrf2的敲除消除了INN诱导的HO-1表达，表明Nrf2是负责INN刺激HO-1表达的转录因子（见图7B、7C）。2.5 AMPK和Nrf2参与INN抑制TNF-α刺激ECs中VCAM-1的表达和单核细胞黏附 接下来，本研究试图确定INN是否阻碍TNF-α诱导的VCAM-1表达。 TNF-α显着增加了VCAM-1表达和HL-60细胞黏附。INN处理可显着抑制TNF-α诱导的VCAM-1 mRNA和蛋白水平表达以及HL-60细胞的黏附。为了进一步确定AMPK和Nrf2在TNF-α刺激的VCAM-1表达中的作用，本研究用化合物C抑制AMPK和shNrf2来敲低Nrf2表达。 化合物C和shNrf2消除了TNF-α触发的VCAM-1表达和HL-60细胞黏附。详见图8。表明AMPK和Nrf2介导INN抑制TNF-α刺激的ECs VCAM-1表达和单核细胞黏附。

［A：将裂解液等分试样（50 μg）进行HO-1蛋白表达的Western Blotting分析；B：从ECs中提取总RNA，并使用HO-1和β-actin的特异性引物进行RT-qPCR；C：如方法中所述，在每个治疗组中测量HO-1 活性3次。数据表示为HO-1活性相对于对照的增加倍数；D：将转染shHO-1的ECs与10 μmol/L INN孵育24 h，然后再用1 ng/mL TNF-α刺激6 h；E：在有或没有INN的情况下，将ECs与1 ng/mL TNF-α孵育8 h，进行黏附测定］

与对照相比，＊ P＜0.05；与INN相比，＃P＜0.05。

［A：对总蛋白进行p-AMPK和AMPK表达的Western Blotting分析；B：ECs用10 μmol/L STO-609和化合物C处理1 h，然后与10 μmol/L INN一起孵育16 h。 对细胞裂解物的等分试样进行HO-1表达的免疫印迹分析； C：提取总RNA，并用HO-1和β-actin的特异性引物进行RT-PCR；D：如方法中所述，在每个治疗组中测量HO-1活性3次。 数据表示为HO-1活性相对于对照的增加倍数；E：ECs用10 μmol/L STO-609和化合物C处理1 h，然后与10 μmol/L INN一起孵育24 h。 如方法所述检测GSH含量］

与对照相比，＊ P＜0.05；与INN相比，＃ P＜0.05（24 h）与INN/shLuc相比，＃ P＜0.05。

［A：ECs用10 μmol/L化合物C处理1 h，然后与10 μmol/L INN孵育指定的时间。细胞裂解物的等分试样进行了免疫印迹分析。B：用shLuc或shNrf2转染ECs，然后用10 μmol/L INN处理16 h。细胞裂解物的等分试样进行了免疫印迹分析；C：从ECs中提取总RNA，并通过RT-PCR及其特异引物将其用于分析HO-1和β-actin mRNA］

与对照比较，＊ P＜0.05；与TNF-α比较，＃  P＜0.05；与TNF-α/INN 比较，△P＜0.05；（n＝3）。

［A：用1 ng/mL TNF-α处理ECs，使用或不使用DMSO（空白载体），INN，或INN＋化合物C进行VCAM-1、p-AMPK和AMPK表达测量。D：在有或没有INN的情况下，将用shLuc或shNrf2转染的ECs与1 ng/mL TNF-α孵育8 h，以测量VCAM-1表达；细胞裂解物的等分试样进行了免疫印迹分析。B、E：提取总RNA，并用针对VCAM-1的特异性引物进行RT-PCR。 C、F：如方法中所述进行黏附测定］

3 讨 论

INN是一种口服抗血小板药物，用于阻止冠状动脉疾病（CAD）中的血块形成［11］。研究表明，INN具有抗炎和抗氧化的作用［12］，可刺激HO-1的表达［13］，通过独立于其抗血小板活性的机制来维持内皮功能［14］。INN可抑制血小板的异常聚集，在糖尿病治疗过程中，有降低血小板活性、促进神经功能早期恢复的作用［15］。INN的作用是改善2型糖尿病病人的血管功能，抵抗氧化应激并抑制细胞凋亡，这涉及磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）和p-AMPK的表达增加。本研究揭示了INN抑制TNF-α刺激的ROS释放、VCAM-1表达和细胞黏附，并且这种作用与通过CaMKKβ/AMPK/Nrf2途径增加HO-1表达和GSH含量有关。

TNF-α是一种促炎细胞因子［4］，由多种先天免疫细胞包括活化的巨噬细胞以及嗜中性粒细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞分泌。在某些病理情况下，例如肿瘤、动脉粥样硬化、类风湿关节炎等，血浆中TNF-α的水平会升高。本研究发现TNF-α可以增加ROS的产生、VCAM-1的表达和细胞黏附，而INN消除了TNF-α的这些作用。

动脉粥样硬化的早期发生是内皮功能障碍，导致几种代偿反应改变了血管的动态平衡。诸如肥胖、高胆固醇血症和高血糖的饮食之类的促炎刺激会引起黏附分子表达，例如VCAM-1在内皮中的表达，这些分子有助于单核细胞和淋巴细胞的附着。VCAM-1的过表达增强单核细胞向内皮损伤部位的募集；白细胞成功释放单核细胞趋化蛋白-1，通过募集其他白细胞，刺激培养基中的白细胞并启动平滑肌细胞的募集和增殖来放大炎症级联反应。本研究证明INN抑制VCAM-1表达，降低了HL-60细胞对TNF-α刺激的ECs的黏附。然而，AMPK抑制剂化合物C、shHO-1和shNrf2消除了这种抑制作用。这些数据证明了AMPK、Nrf2和HO-1对INN抑制HL-60细胞黏附的贡献。

HO-1是一种压力诱导酶［6］，可预防许多慢性疾病，例如心血管疾病、高血压、糖尿病。Nrf2是细胞内重要的转录因子［16-17］，与细胞的抗炎作用有关。Nrf2/HO-1信号通路具有抗炎、抗氧化应激等作用［18］。Nrf2 是保护细胞抗氧化和炎性损伤信号通路的关键协调者，HO-1 是受其调控的抗氧化应激和抗炎症反应的重要基因［16］。本研究中，INN增强了Nrf2的核易位，而沉默Nrf2消除了INN诱导的HO-1表达，表明Nrf2对于INN诱导的HO-1表达是必不可少的。Nrf2激活受几种激酶控制，包括c-Jun氨基端激酶（JNK）、p38、细胞外信号调节激酶（ERK）和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt等。本研究证明了INN可以激活CaMKKβ和AMPK。通过使用CaMKKβ和AMPK的特异性抑制剂，揭示了CaMKKβ/AMPK途径与INN触发的HO-1诱导有关。

总之，本研究发现INN通过CaMKKβ/AMPK/Nrf2通路上调HO-1表达、升高GSH水平来阻碍TNF-α诱导的ROS形成、VCAM-1表达和HL-60细胞黏附。INN的抗氧化和抗炎特性可预防由氧化应激引起的疾病，包括动脉硬化。

参考文献：

［1］ 周振锋，马爱军，潘旭东.炎症和自噬及泛素化对动脉粥样硬化的作用［J］.中华老年心脑血管病杂志，2019，21（11）：1211-1213.

［2］ 郭建恩，高飞，胡亚涛，等.瓜蒌薤白半夏汤对动脉粥样硬化小鼠炎症因子、ICAM-1、VCAM-1表达的影响［J］.暨南大学学报（自然科学与医学版），2017，38（3）：234-239.

［3］ 王新，孙蓓，刘芳，等.间歇低氧下小鼠血管内皮功能障碍机制的研究［J］.天津医药，2017，45（2）：160-163.

［4］ JIA Z Q，NALLASAMY P，LIU D M，et al.Luteolin protects against vascular inflammation in mice and TNF-alpha-induced monocyte adhesion to endothelial cells via suppressing IκBα/NF-κB signaling pathway［J］.The Journal of Nutritional Biochemistry，2015，26（3）：293-302.

［5］ 孙东，宋红丽，沈中阳.血红素加氧酶1修饰MSCs的相关研究进展［J］.中国修复重建外科杂志，2019，33（7）：901-906.

［6］ WANG F，XIAO M，LIN X J，et al.Expression of heme oxygenase-1 and leukemia inhibitory factor in maternal plasma and placental tissue in a lipopolysaccharide-induced late pregnancy preterm birth mouse model［J］.The Journal of Reproductive Medicine，2016，61（1/2）：39-46.

［7］ 叶海琼，傅晓冬，钟华.激活AMPK对妊娠高血压大鼠HO-1水平、血压和尿蛋白的影响［J］.重庆医学，2019，48（2）：217-220.

［8］ WEI C Y，SUN H L，YANG M L，et al.Protective effect of wogonin on endotoxin-induced acute lung injury via reduction of p38 MAPK and JNK phosphorylation［J］.Environmental Toxicology，2017，32（2）：397-403.

［9］ YANG J，SUNG J，KIM Y，et al.Inhibitory effects of butein on adipogenesis through upregulation of the Nrf2/HO-1 pathway in 3T3-L1 adipocytes［J］.Preventive Nutrition and Food Science，2017，22（4）：306-311.

［10］ 延光海，孙天一，咸哲民，等.朝医麻黄定喘汤对支气管哮喘模型小鼠p38MAPK/Nrf2/HO-1信号通路的影响［J］.中医杂志，2019，60（10）：881-886.

［11］ HONG K S，LEE S H，KIM E G，et al.Recurrent ischemic lesions after acute atherothrombotic stroke：clopidogrel plus aspirin versus aspirin alone［J］.Stroke，2016，47（9）：2323-2330.

［12］ 刘忠明，刘志阳.替格瑞洛与氯吡格雷对ST段抬高急性心肌梗死患者PCI术后炎症因子和预后的影响［J］.武汉大学学报（医学版），2019，40（6）：1013-1016.

［13］ 沈钦龙，孙金鑫，夏海艳.苦蝶子注射液联合氯吡格雷治疗急性脑梗死的临床研究［J］.现代药物与临床，2019，34（1）：31-35.

［14］ PAN Y S，JING J，CHEN W Q，et al.Risks and benefits of clopidogrel-aspirin in minor stroke or TIA：time course analysis of CHANCE［J］.Neurology，2017，88（20）：1906-1911.

［15］ 王珊珊.氯吡格雷对急性脑梗死合并糖尿病患者疗效及血清血管活性因子、血小板活化参数的影响［J］.山东医药，2019，59（17）：51-53.

［16］ 闫焱.N-乙酰半胱氨酸对术后认知功能障碍模型小鼠认知功能及核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1信号通路的影响［J］.中国医学科学院学报，2019，41（4）：529-535.

［17］ GASPARRINI M，AFRIN S，FORBES-HERNNDEZ T Y，et al.Protective effects of Manuka honey on LPS-treated RAW 264.7 macrophages.Part 2：control of oxidative stress induced damage，increase of antioxidant enzyme activities and attenuation of inflammation［J］.Food and Chemical Toxicology，2018，120：578-587.

［18］ 莫泽纬，王斐，魏伟平，等.艾塞那肽对胰岛素抵抗大鼠的肾损伤和核因子相关因子2/血红素加氧酶通路的影响［J］.中国临床药理学杂志，2019，35（14）：1474-1478.

（收稿日期：2020-12-22）

（本文编辑王丽）