HPLC法测定二十五味阿魏胶囊中非法添加卡托普利、氯氮 、盐酸异丙嗪、硝苯地平的含量

查道仁

(安徽省安庆市立医院，安徽安庆 246003)

二十五味阿魏胶囊质量标准收载于《国家中成药标准汇编中成药地标升国标·经络肢体脑系分册》(WS-10430(ZD-0430)-2002)，由阿魏等二十五味中药组成［1］，具有祛风镇静作用。由于4种镇静类化学药物(卡托普利、氯氮、盐酸异丙嗪、硝苯地平)的原料价廉易得，完全可能被不法分子用来添加到二十五味阿魏胶囊等同类中成药中，有必要建立高效液相色谱测定方法［2］，检测样品中可能违法添加的4种镇静类化学药物的含量。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪:Shimadzu LC-20A全自动高效液相色谱仪;电子天平:METTLER AE240;卡托普利(KT)、氯氮 (LD)、盐酸异丙嗪(YB)和硝苯地平(XB)对照品:中国药品生物制品检定所提供，批 号 分 别 为 100318-200602、171248-200301、100422-200501、100338-200502;甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯;水为重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Inertsil ODS-SP(Shimadzu C18250 mm×4.6 mm);流动相:乙腈—稀磷酸(每100 mL水中含0.2 mL磷酸)，按表1进行梯度洗脱;柱温:室温;检测波长:KT检测波长为215 nm，LD、YB和XB检测波长245 nm。流速:1.0 mL·min-1;进样量:10 μL。

2.2 溶液的制备 对照品溶液的制备:避光操作。精密称定KT、LD、YB和XB对照品，分别加甲醇制成浓度为20 mg·L-1的溶液，即得。其色谱图见图1。

供试品溶液的制备:避光操作。取本品内容物，研细，精密称定0.5 g，置锥形瓶中，精密加入氯仿20.0 mL，密塞，称定重量，超声处理10 min，放冷后加氯仿补足减失重量，摇匀，离心。精密吸取上清液10.0 mL置蒸发皿中，挥干，残渣加甲醇使溶解，定容至25 mL容量瓶中，0.45 μm滤膜滤过，即得。其色谱图见图2。

加入4种对照品的供试品溶液的制备:取供试品，在定容前加入一定体积的4种对照品贮备液，其余方法同供试品溶液的制备，制成KT(4 mg·L-1)、LD(15 mg·L-1)、YB(5 mg·L-1)、XB(25 mg·L-1)后摇匀，即得。其色谱图见图3。

表1 梯度洗脱流动相

图1 4种混合对照品

图2 二十五味阿魏胶囊供试品

图3 加4种混合对照品的供试品

2.3 系统适应性试验 取4种混合对照品溶液，注入液相色谱仪中，结果4种对照品理论板数均大于4 000;分离度为3.3(应≥1.5)，拖尾因子为0.995(应为0.95～1.05)，重复性试验RSD均小于2.0%，均符合药典规定。

2.4 标准曲线的制备 分别精密称取KT、LD、YB和 XB 对照品 10.12、11.16、9.93、9.81 mg，加甲醇溶解定容至10 mL，制成每1 mL含 KT 1.012 mg、LD 1.116 mg、YB 0.993 mg、XB 0.981 mg 的溶液，作为对照品贮备液。精密吸取各贮备液，加甲醇制成系列浓度的混合对照品溶液。吸取上述溶液各5 μL，注入液相色谱仪，依法测定。以进样量C(μg)为横坐标，峰面积A为纵坐标，得回归方程、相关系数分别为:KT:A=1×106C-6 584.2;r2=1(n=6);LD:A=6×106C-34 368;r2=1(n=6);YB:A=4×106C-22 607;r2=0.999 9(n=6):XB:A=3×106C-11 176;r2=1(n=6)。结果 KT、LD、YB 和XB 分别在 0.010 12～2.47 μg，0.011 16 ～1.116 μg、0.009 93 ～0.993 μg和 0.009 81 ～0.981 μg 范围内线性关系良好。

2.5 精密度实验 避光操作。精密吸取一份混合对照品溶液5 μL，重复进样6次，测定峰面积分值的相对标准偏差(RSD)。结果KT、LD、YB和XB峰面积的 RSD分别为 1.38%、0.50%、0.70%、2.11%，表明本法精密度较好。

2.6 稳定性试验 避光操作。精密吸取一份混合对照品溶液，室温下放置，分别于 0、1、2、4、10 h 按上述方法测定，测定其峰面积积分值A，结果KT、LD、YB和 XB峰面积的 RSD值分别为1.81%、0.68%、0.72%、2.26%，表明样品溶液在10 h内较稳定。

2.7 加样回收率试验 避光操作。精密称取0.5 g样品(批号20100501)6份，分别精密加入每1 mL含卡托普利0.518 0 mg、氯氮 0.709 0 mg、盐酸异丙嗪0.543 0 mg、硝苯地平1.071 mg的混合对照品溶液1.0 mL，置锥形瓶中，再精密加入氯仿19.0 mL，制成供试品溶液。精密吸取每1 mL含卡托普利0.518 0 mg、氯氮 0.709 0 mg、盐酸异丙嗪0.543 0 mg、硝苯地平1.071 mg的混合对照品溶液1.0 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为对照品溶液。分别吸取供试品溶液和对照品溶液各5 μL，注入液相色谱仪，依法测定，计算回收率。结果KT、LD、YB和XB的平均回收率分别为98.70%(RSD=2.86%，n=6)、97.19%(RSD=2.71%，n=6)、95.90%(RSD=2.48%，n=6)、99.41%(RSD=1.98%，n=6)，表明本法的准确性较好。

3 讨论

3.1 检测波长的选择 在上述色谱条件下，分别精密吸取各对照品溶液5 μL，注入液相色谱仪，各色谱峰用PDA检测器在200～400 nm波长范围内进行光谱扫描，结果显示KT在200～400 nm波长范围内，紫外最大吸收不明显，参照《中国药典》2010年版二部选择215 nm作为卡托普利的液相色谱检测波长［3-4］;LD的最大吸收波长在245 nm和308 nm 处［5］，YB、XB 在245 nm 波长处均有较大吸收［6-8］，故选择245 nm 作为 LD、YB和 XB的液相色谱检测波长［9-10］。

3.2 提取溶剂的选择 KT、LD、YB和XB在氯仿和甲醇中均易溶或溶解，但甲醇作为供试品提取溶剂时，样品中其它成分干扰严重，色谱峰分离效果差，加样回收率达不符合要求，而以氯仿为溶媒提取分离效果较好，故选择氯仿作为供试品的提取溶剂。

3.3 色谱柱的选择 避光操作。取回收率实验的同一份供试品溶液，分别在APOLLO C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)和大连依利特 C18(250 mm × 4.6 mm，ODS2，5 μm)两种色谱柱条件下，各进样2 次测定，结果显示，在APOLLO C18色谱柱条件下，KT、YB分离度较差，LD、XB，两峰峰形及分离度相对较好。大连依利特 C18色谱柱条件下仅KT、XB出峰。结果表明 APOLLO C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)色谱柱基本适用于本法，大连依利特 C18(250 mm×4.6 mm，ODS2，5 μm)色谱柱不适用于本法。

3.4 柱温箱温度影响试验 避光操作。取回收率实验的同一份对照品溶液，分别在柱温箱温度为25、30、35、40 ℃进样测定。样品色谱图上，KT、LD、YB和XB各峰峰形及分离度均较好。表明柱温箱温度对色谱分离的影响较小，本法适用于柱温箱温度低于40℃。

3.5 流动相的选择 取回收率实验的同一份供试品溶液，分别在流动相为不同比例、不同梯度的甲醇—0.05%磷酸、甲醇—乙腈—0.2%磷酸、乙腈—0.2%磷酸进样测定，试验结果表明，选用乙腈—0.2%磷酸在前述梯度条件下，KT、LD、YB和XB各峰峰形及分离度均较好，二十五味阿魏胶囊样品在相应位置上无干扰。

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