氧化应激在 TRAIL诱导Hela细胞凋亡中的作用

叶记林，于有江，吴爱莲，王冬燕，彭建明，刘永春，刘延庆

(1．扬州市职业大学医学院，江苏 扬州 225009;2．江苏省苏北人民医院儿科，江苏 扬州 225000;3．扬州大学医学院，江苏扬州 225001)

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL)是一种具有良好前景的治疗肿瘤的药物，它能选择性诱导多种肿瘤细胞凋亡，而对正常组织无明显损伤。但较高浓度的TRAIL对人体正常细胞也有损伤，多种肿瘤细胞株对TRAIL诱导的凋亡并不敏感等问题阻碍了 TRAIL的应用［1]。弄清TRAIL诱导癌细胞凋亡的发生机制是突破点。近年来，越来越多的实验证明，TRAIL诱导多种肿瘤细胞凋亡与氧化应激密切相关［2－3]。然而TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的氧化应激作用的具体机制研究很少，现以Hela细胞为模型探讨TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的氧化应激作用，为临床肿瘤治疗提供参考。我们以往的实验证实TRAIL诱导Hela细胞凋亡中线粒体途径发挥了重要作用［6]，本实验拟进一步探讨氧化应激作用与线粒体途径的关系。

1 材料与方法

1．1 材料 人宫颈癌 Hela细胞购自中国科学院上海细胞生物库。Human TRAIL蛋白购于 Millipore公司，DMEM培养基购于Gibco公司，小牛血清购于杭州四季青公司，MTT和二甲基亚砜(DMSO)购于Amresco公司，N－乙酰半胱氨酸(NAC)购于Calbiochem公司，GSH、MDA检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所，Bcl-2、Cyt C、DR 4、DR 5 抗体购自Cell Signal公司，MRC－1024型激光共聚焦仪和流式细胞仪为美国BIO－RAD公司产品。

1．2 实验方法

1．2．1 细胞培养 Hela细胞用含10% 小牛血清的DMEM 培养液，在 37℃，5%CO2饱和湿度下培养。选择对数生长期的细胞用于实验。设生理盐水对照组、TRAIL组(终浓度为40μg·L－1)、抗氧化剂 NAC 组(终浓度为10 mmol·L－1)、TRAIL+NAC组(先用10 mmol·L－1NAC预处理细胞2 h，然后加入 TRAIL)。当细胞处理时，换含2%小牛血清的培养液进行培养。

1．2．2 MTT法检测细胞增值的抑制 取对数生长期细胞，以2×105/孔细胞接种于24孔板。分组处理细胞，每组设6个复孔。药物作用后每孔加入0．5 g·L－1MTT 300 μL，孵育 4 h后弃去培养液，每孔加入 DMSO 500μL，振荡10 min，完全显色后，转移至96孔板，用酶标仪在570/630 nm波长测吸光度OD值(OD值代表相对活细胞数)。

1．2．3 分光光度比色法分析 GSH、MDA含量的变化 分组处理细胞，将收集的细胞用预冷的 PBS(pH 7．2)重悬，超声破碎细胞制成匀浆液，4℃ 离心，取上清液，采用分光光度比色法检测细胞匀浆液总蛋白含量，GSH、MDA含量检测严格按试剂盒说明书进行。

1．2．4 流式细胞仪测定胞内活性氧水平 参照文献［7]方法，细胞用10μ mol·L－1DCFH-DA 在 37℃ 孵育45 min，然后分组加药处理细胞。细胞孵育后用PBS漂洗，用流式细胞仪以488 nm为激发波长，530 nm为发射波长测定细胞内的绿色荧光强度。每份样品记10 000个细胞。

1．2．5 Rh-123结合激光共聚焦检测线粒体膜电位(ΔΨm) 按照文献［6]的方法进行，收集处理后的各组细胞用PBS洗涤2次，然后加入罗丹明123(Rh-123)，使其终浓度为 5 mg·L－1，37℃ 闭光孵育20 min，再用PBS洗3遍，激光共聚焦显微镜于505 nm激发光、534 nm发射光实时监测细胞胞内荧光强度。统计每个样品中所有受检测细胞的荧光强度值的均值，该值即反映相对ΔΨm的强度。

1．2．6 Western blot检测 Bcl-2、Cyt C、DR 4 和DR 5

收集处理后的各组细胞。按常规方法提取蛋白质，恒压进行SDS电泳分离，然后电转到 PVDF膜上，分别与 Bcl-2兔多抗、鼠抗人 DR 4单抗、鼠抗人DR 5单抗、4℃ 孵育过夜，再加入羊抗兔 IgGHRP室温孵育1 h，将膜洗涤干净后，加 TMB显色液显色、摄影。一部分细胞参照文献分离［8]细胞质蛋白。以 Cyt C鼠单抗为一抗检测 Cyt C蛋白含量。

1．2．7 统计与分析 应用 SigmaPlot 12．0及 Excel 2003统计软件，所有实验重复3次或以上，结果以x±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两独立组间比较采用LSD－t检验。以P＜0．05为差异有显着性。

2 结果

2．1 TRAIL对 Hela细胞生长的影响 40μg·L－1TRAIL作用于Hela细胞12 h后，对细胞的生长具有显着的抑制作用 (P＜ 0．01)。40μg·L－1TRAIL+10 mmol·L－1NAC组虽然也对细胞生长有抑制作用，但与单独 TRAIL组比较，NAC能明显减弱 TRAIL对 Hela细胞的生长抑制作用，P=0．000。而单独的 NAC对细胞的生长没有明显影响(图1)。

图1 TRAIL对Hela细胞增殖的抑制作用(x ±s，n=4)

2．2 TRAIL引起细胞GSH、MDA含量的变化

由表1可知，单独40μg·L－1TRAIL作用组，随着作用时间的延长，Hela细胞内抗氧化因子 GSH含量与对照组比较，从2 h开始均有显着降低 (P＜0．01)，且呈现时间依赖性;氧化应激产物 MDA含量在TRAIL作用2 h时基本不变，只是从4 h开始逐渐降低，且呈现时间依赖性。

40 μg·L－1TRAIL+10 mmol·L－1NAC 组，抗氧化因子 GSH含量从4 h开始才略有降低，到8 h GSH 含量仍然有(116．2 ± 4．7)mg·g－1Pro，明显高于单独 TRAIL处理8 h GSH含量(57．7±1．2)mg·g－1Pro，与对照组相比相差不多;而 MDA含量随着作用时间延长基本维持不变。

表1 TRAIL，NAC+TRAIL作用不同时间引起GSH、MDA含量变化(x ±s，n=4)

2．3 TRAIL引起细胞内 ROS含量变化 由图2可知，以DCFC-DA转化生成的平均荧光强度代表ROS含量，40μg·L－1TRAIL作用的细胞从2 h开始细胞内绿色荧光强度明显提高，产生的ROS量随着作用时间的延长不断升高，到4 h时ROS的含量已经达到了对照组的2．33倍。而 NAC能完全抑制TRAIL导致的细胞内 ROS的含量升高(数据未显示)。

图2 流式细胞仪检测TRAIL引起细胞内ROS的变化

2．4 TRAIL引起 Hela细胞 ΔΨm 的变化 如图3所示，Rh-123荧光强度值反映的是线粒体膜电位(ΔΨm)的大小。TRAIL处理4 h组与对照组相比ΔΨm变化不大，随着处理时间的延长，ΔΨm逐渐降低，呈现明显的时间依赖性 (P＜0．01)。而NAC能完全抑制TRAIL引起的ΔΨm下降。

图3 激光共聚焦显微镜检测细胞线粒体的Rh-123荧光强度值变化(x ±s，n=4)＊＊

2．5 TRAIL 引起 Hela 细胞 Bcl-2、Cyt C、DR4、DR5蛋白量的变化 图4(a)、4(b)显示，与对照组相比，40μg·L－1TRAIL作用8 h后能明显下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，提高死亡受体DR 5的表达，引起细胞线粒体内Cyt C向细胞质的释放，但对死亡受体DR 4的表达基本没有影响。而 NAC能完全抵消TRAIL引起的这些蛋白量的改变。

图4 TRAIL处理 Hela细胞中的Bcl－2、Cyt c、DR4、DR5蛋白量的变化

3 讨论

近年的研究证实，氧化应激与TRAIL引起的多种细胞凋亡密切相关［2－3]然而 TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的氧化应激作用的具体机制还不清楚。本实验结果显示TRAIL对Hela细胞的生长具有显着的抑制作用(图1)，我们已经证实这种抑制主要是TRAIL通过诱导 Hela细胞凋亡进行的［4]。抗氧化剂NAC能明显减弱TRAIL对 Hela细胞的生长抑制作用，与Gatsinzi等报道的NAC能完全抑制多种药物联合TRAIL诱导的细胞凋亡作用结果相似［8]。这些表明氧化应激在TRAIL引起的Hela细胞凋亡中起重要作用。

经TRAIL处理后，Hela细胞内抗氧化代表物质GSH含量从2 h开始均有显着降低(表1)，活性氧ROS的含量也是从2 h开始随着作用时间的延长不断升高。氧化应激主要产物 MDA含量在TRAIL作用2 h时基本不变，只是从4 h开始逐渐升高。而抗氧化剂NAC能基本消除TRAIL对Hela细胞产生的氧化应激作用 (表1)。GSH、ROS含量变化先于 MDA含量变化。这表明 TRAIL可以使细胞的氧化应激效应增强。而这可能是因为TRAIL首先抑制了抗氧化物质 GSH的生成，导致细胞清除ROS能力降低，使得ROS水平急剧升高，从而引发脂质过氧化反应而导致MDA含量的升高和细胞增值的抑制，与先前的报道相一致［7]。

在许多细胞的凋亡过程中，ROS的增加与线粒体凋亡途径关系密切［7－8]。而 TRAIL诱导 Hela细胞凋亡的可能途径之一是通过线粒体进行的［6]。本实验进一步探讨了 ROS的增加与线粒体凋亡途径的关系。TRAIL处理4 h组与对照组相比线粒体膜电位 ΔΨm变化不大，到6 h时 ΔΨm明显降低(图4)。另外，TRAIL作用8 h后能明显下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，引起细胞线粒体内Cyt c向细胞质的释放(图4)。实验结果表明 ROS的升高 (TRAIL处理2 h时开始不断升高)是 TRAIL诱导Hela细胞凋亡的早期事件，要先于 ΔΨm下降 (TRAIL处理 6 h时开始明显降低)的发生。而NAC能抑制TRAIL引起的ΔΨm下降，也能完全抵消TRAIL引起的这些蛋白量的改变。提示ROS升高可直接或间接损伤线粒体而引发线粒体凋亡途径。其机制可能是ROS升高引起抗凋亡蛋白Bcl-2表达量下降和细胞线粒体氧化损伤，使线粒体膜电位下降，引起Cyt C等凋亡蛋白的释放，从而通过激活Caspases通路导致细胞凋亡。

TRAIL作用的主要途径是与死亡受体DR 4和DR 5结合，招募FADD(Fas-associated death domain protein)，并进一步激活 Caspase-8，形成死亡诱导信号复合物，最后将活化信号传递并激活 Caspase-3，从而发挥诱导细胞凋亡的生物学功能，这是TRAIL凋亡的非线粒体途径［9－10]。本实验结果显示TRAIL处理后能上调死亡受体 DR 5的表达，但对死亡受体DR 4的表达基本没有影响。而 NAC能完全抑制 TRAIL所引起的 DR 5的升高 (图4)。提示TRAIL诱导Hela细胞凋亡的可能途径之一是通过ROS途径上调DR 5表达而进行的，与DR 4无关，这与以往的报道类似［11－12]。

综上所述，氧化应激在 TRAIL引起的 Hela细胞凋亡中起着重要作用，其机制可能是TRAIL导致抗氧化物质 GSH含量降低，清除 ROS能力降低，ROS水平急剧升高。ROS升高一方面导致抗凋亡蛋白Bcl-2表达量下降和细胞线粒体氧化损伤而激活线粒体凋亡通路。另一方面通过上调死亡受体DR 5表达而执行非线粒体凋亡途径。本实验为将TRAIL用于临床肿瘤治疗提供了一定的实验参考，也为TRAIL凋亡增敏剂的探索提供了研究基础。

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