程秀芳，陈俊松

支气管哮喘为一种涉及多种炎性细胞(如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞等)及介质的慢性气道炎症性疾病，气道重塑及气道高反应性为其基本病理特点[1-3]。由于小儿支气管病理过程复杂，尚无明确发病机制，在辅助性T细胞1型(Th1)/辅助性T细胞2型(Th2)细胞之间的平衡失调导致Th2细胞占据主要地位被认为是最经典的哮喘病理机制理论，研究证实Th1、辅助性T细胞9型(Th9)、辅助性T细胞17型(Th17)及相关细胞因子在儿童支气管哮喘病理过程中扮演重要角色[4-5]。肺炎支原体(MP)感染被认为是诱发哮喘的重要因素，有学者推测MP可特异性诱导免疫球蛋白IgE产生并与肥大细胞及嗜碱性细胞受体结合，使致敏的肥大细胞、嗜碱性粒细胞脱颗粒，释放组胺、慢反应物质等炎性介质，而诱发或加重哮喘，因此MP感染与哮喘发作关系密切[6]。本研究主要分析MP感染对支气管哮喘儿童外周血Th1、Th9、Th17及相关细胞因子水平的影响，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2015年1月至2018年1月安阳市人民医院收治的78例伴MP感染支气管哮喘病儿、86例单纯支气管哮喘病儿、50例健康儿童为研究对象，分别纳入MP阳性组、MP阴性组、对照组。纳入标准：(1)支气管哮喘病儿符合《中国支气管哮喘防治指南(基层版)——支气管哮喘的诊断与鉴别诊断》[7]中支气管哮喘诊断标准，有喘息、气促、胸闷、咳嗽表现；(2)MP阳性病儿入院1周测定的肺炎支原体抗体(MP-IgM)效价较入院时倍数升高；(3)本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求，病儿近亲属知情同意并签署知情同意书。排除标准：(1)其他呼吸道疾病、结核或其他合并细菌与病毒感染者；(2)心、肝、肾严重功能障碍者；(3)严重血液系统疾病或其他病原体感染儿童；(4)其他原因引起的喘息、气促、胸闷、咳嗽或近期有呼吸道感染病史者。MP阳性组中男44例，女34例；年龄范围为3～9岁，年龄(6.13±0.78)岁；支气管哮喘病程范围为23～29个月，病程(26.11±2.72)个月。MP阴性组中男49例，女37例；年龄范围为3～10岁，年龄(6.15±0.75)岁；支气管哮喘病程范围为24～29个月，病程(26.25±2.22)个月，两组性别、年龄、支气管哮喘病程比较差异无统计学意义(χ2=0.005，P=0.942；t=0.167，P=0.867；t=0.362，P=0.718)。对照组中男26例，女24例；年龄范围为3～9岁，年龄(6.14±0.76)岁，与MP阳性组、MP阴性组性别、年龄相比，差异无统计学意义(与MP阳性组比较：χ2=0.239，P=0.625；t=0.072，P=0.943；与MP阴性组比较：χ2=0.317，P=0.574；t=0.075，P=0.941)。

1.2 方法

1.2.1MP检测方法 取受检者静脉血2 mL，在3 000 r/min下离心10 min，分离血清后保存于-80 ℃下待测，采用日本富士Serodia-Myco Ⅱ MP抗体诊断试剂盒，以被动凝集实验检测血清MP特异性抗体(MP-IgM)，严格按照说明书操作。MP阳性标准：滴度>1∶80，同时分为1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280、1∶2 560等不同滴度，本研究选择1∶80、1∶320、1∶1 280三个滴度进行分析。

1.2.2Th1、Th9、Th17及相关细胞因子水平测定 采集受检者空腹静脉血6 mL，其中3 mL于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，分离单个核细胞(PBMCs)，洗涤2次后重悬于RPMI-1640培养液，进行胞外染色、细胞培养、固定破膜、胞内染色，以美国Beckman Cloulter公司提供的CytomicsTMFC500型流式细胞仪检测各淋巴细胞膜及细胞因子荧光强度，界定CD4+IL-1+为Th1细胞，CD4+IL-9+为Th9细胞，CD4+IL-17+为Th17细胞。另取3 mL静脉血，3 000 r/min离心10 min，分离血清，保存于-80 ℃，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定γ-干扰素(IFN-γ)、白介素-18(IL-18)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。IFN-γ试剂盒购自武汉博士德公司，IL-18、TNF-α试剂盒分别由上海森雄科技实业有限公司、北京晶美生物制剂公司提供。检测过程严格按照试剂盒说明书进行。

1.3 观察指标(1)比较三组病儿入院时外周血Th1、Th9、Th17及IFN-γ、IL-18、TNF-α水平；(2)分析MP阳性组中，不同MP-IgM滴度病儿外周血Th1、Th9、Th17及IFN-γ、IL-18、TNF-α水平；(3)比较MP阳性组中急性发作期、缓解期病儿外周血Th1、Th9、Th17及IFN-γ、IL-18、TNF-α水平；(4)分析MP-IgM滴度与各指标相关性。

2 结果

2.1 三组Th1、Th9、Th17及相关细胞因子比较MP阳性组外周血Th1低于MP阴性组、对照组(t=6.396，P=0.000；t=15.492，P=0.000)，MP阳性组Th9、Th17、IFN-γ、IL-18、TNF-α水平高于MP阴性组、对照组(与MP阴性组比较，tTh9=21.494，PTh9=0.000；tTh17=18.593，PTh17=0.000；tIFN-γ=6.399，PIFN-γ=0.000；tIL-18=9.361，PIL-18=0.000；tTNF-α=26.593，PTNF-α=0.000；与对照组比较，tTh9=43.186，PTh9=0.000，tTh17=35.184，PTh17=0.000，tIFN-γ=34.634，PIFN-γ=0.000，tIL-18=7.891，PIL-18=0.000，tTNF-α=34.979，PTNF-α=0.000)，MP阴性组、对照组上述指标比较也差异有统计学意义(tTh1=10.826，PTh1=0.000；tTh9=30.168，PTh9=0.000；tTh17=18.917，PTh17=0.000；tIFN-γ=30.975，PIFN-γ=0.000；tIL-18=14.071，PIL-18=0.000；tTNF-α=16.871，PTNF-α=0.000)，见表1。

2.2 不同MP-IgM滴度病儿Th1、Th9、Th17及相关细胞因子比较MP阳性病儿中，MP-IgM滴度分别为1∶80 10例、1∶160 13例、1∶320 14例、1∶640 19例、1∶1 280 10例、1∶2 560 12例，本研究选择1∶80、1∶320、1∶1 280滴度进行分析。随MP-IgM滴度增加，Th1呈下降趋势，而Th9、Th17、IFN-γ、IL-18、TNF-α上升，尤其是Th9、Th17、TNF-α在不同滴度病人中比较均差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.3 不同哮喘发作期病儿Th1、Th9、Th17及相关细胞因子比较MP阳性病儿中，急性发作期40例、缓解期38例，急性发作期Th1低于缓解期，急性发作期Th9、Th17、IFN-γ、IL-18、TNF-α高于缓解期(P<0.05)，见表3。

2.4 MP-IgM滴度与各指标相关性分析相关性分析显示，支气管哮喘伴MP感染病儿MP-IgM滴度与外周血Th1呈负相关，与Th9、Th17、IFN-γ、IL-18、TNF-α呈正相关(P<0.05)，见表4。

表4 MP-IgM滴度与各指标相关性分析

3 讨论

支气管哮喘是儿童常见变态反应性疾病，我国第三次城市儿童哮喘流行病学资料调查显示，儿童哮喘的患病率、累计患病率与前次调查相比，分别增加50.6%、52.8%[8-9]。T细胞尤其是Th1及Th9细胞、Th17细胞在诱导哮喘发作、气道炎症方面已被证实具有重要作用，复杂的免疫反应会导致Th1细胞表达缺失，而导致Th9细胞、Th17细胞表达增加，有研究发现轻中度过敏性哮喘病人急性发作期Th9细胞、Th17细胞的特异性基因表达与特异性细胞因子生成增加[10-11]。长期临床实践发现MP感染是诱发儿童支气管哮喘的重要因素，MP诱发哮喘的机制包括MP黏附纤毛上皮细胞，引起纤毛功能损伤及上皮细胞破坏，可作为特异性抗原，引起气道变态反应，加重哮喘儿童气道炎症反应，同时这也涉及病儿易感体质个体特征[12-13]。但目前关于MP感染对支气管哮喘病儿Th1、Th9、Th17及相关细胞因子的影响较少报道。

表1 三组Th1、Th9、Th17及相关细胞因子比较

注：三组各指标整体比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。与对照组比较，aP<0.05；与MP阴性组比较，bP<0.05

表2 不同MP-IgM滴度病儿Th1、Th9、Th17及相关细胞因子比较

注：MP-IgM 1∶80、1∶320、1∶1 280各滴度Th1、Th9、Th17及相关细胞因子比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。与1∶80滴度比较，aP<0.05；与1∶320滴度比较，bP<0.05

表3 伴MP阳性不同哮喘发作期病儿Th1、Th9、Th17及相关细胞因子比较

Th1细胞为CD4阳性细胞，主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α等致炎因子，在活化巨噬细胞、组织细胞内微生物感染、抗肿瘤反应等方面有重要作用。其中TNF-α是一种具有多种生物学效应的细胞因子，能增加中性粒细胞与嗜酸性粒细胞功能，刺激其产生超氧化物，释放溶酶体酶，对周围细胞产生毒性作用，IL-18也与哮喘急性发作密切相关，IFN-γ是Th1型细胞因子，对Th2型淋巴细胞形态及功能有抑制作用[14-15]。本次研究结果显示MP阳性组外周血Th1低于MP阴性组、对照组；MP阳性组Th9、Th17、IFN-γ、IL-18、TNF-α水平高于MP阴性组、对照组；MP阴性组、对照组上述指标比较差异有统计学意义，表明MP感染不仅会加重恶性肺部病变，也会影响支气管哮喘病儿Th1、Th9、Th17、IFN-γ、IL-18、TNF-α水平，通过IFN-γ、IL-18、TNF-α等细胞因子，上调辅助性T淋巴细胞Th9、Th17细胞免疫反应，下调Th1，而使T淋巴细胞失衡，加重哮喘[16]，这与康玉亭等[17]通过研究得出的支原体肺炎病儿Th1、Th2型细胞因子(IL-18、TNF-α)水平升高可能在支原体肺炎伴喘息病儿中发挥重要作用的结论相似。本研究也显示，MP阳性病儿中，随MP-IgM滴度增加，Th1呈下降趋势，而Th9、Th17、IFN-γ、IL-18、TNF-α上升，尤其是Th9、Th17、TNF-α在不同滴度病人中比较均差异有统计学意义，同时与哮喘缓解期病儿相比，哮喘急性发作期病儿Th1下降，Th9、Th17、IFN-γ、IL-18、TNF-α水平升高，这与文献[18]的报道结果基本一致，Th1细胞主要通过分泌Th1型细胞因子，增加巨噬细胞介导的抗感染与抗细胞内病原体感染的免疫反应，主要分泌IFN-γ、TNF-α，Th9可分泌高水平IgE，产生气道嗜酸性粒细胞性炎症，促进气道黏液分泌与嗜酸性粒细胞聚集，增加气道高反应性[19]，而Th17具有相对独立的增殖、分化、调节机制，可特异性产生IL-17等细胞因子，激活哮喘病人成纤维细胞、巨噬细胞，产生并分泌一系列与气道重构有关的细胞因子如TNF-α等，参与介导哮喘的发病与调节[20]，因而本次研究可观察到随MP-IgM滴度增加，哮喘急性发作，支气管哮喘病儿Th1下降，而Th9、Th17、IFN-γ、IL-18、TNF-α呈上升趋势。此外本研究相关性分析也显示，支气管哮喘伴MP感染病儿MP-IgM滴度与外周血Th1呈负相关，与Th9、Th17、IFN-γ、IL-18、TNF-α呈正相关，进一步证实了MP感染与支气管哮喘病儿Th1、Th9、Th17及相关细胞因子的关系。

综上所述，MP感染可下调支气管哮喘病儿Th1，上调其Th9、Th17、IFN-γ、IL-18、TNF-α水平，而加重气道高反应性，尤其在哮喘急性发作期上述因子变化更明显，临床应加以监测。