山楂多糖提取物上调miR-146a-5p抑制Wnt/β-catenin信号通路影响胃癌细胞增殖和凋亡

李孝平，李伟，高芳芳，黄朝刚，何天佑，孙智珺

作者单位：武汉市第三医院普外科，湖北 武汉430060

胃癌是我国常见的消化道恶性肿瘤之一，严重威胁我国人民的生命健康，近年来研究发现中医药对胃癌的防治具有良好疗效。中药多糖可通过药理因素调节人体免疫功能，且具有抗肿瘤作用，能够为医学临床肿瘤治疗提供有效帮助。研究报道猕猴桃根多糖、红花多糖可抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖，诱导其凋亡。山楂多糖是山楂中有效生物活性物质，具有抗疲劳、增强免疫力、抗氧化、抗肿瘤以及调血脂等药理作用。有研究发现山楂多糖提取物可诱导人结肠癌细胞凋亡。而山楂多糖提取物对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制尚未可知。miRNA 能够调节细胞增殖、分化和凋亡等多种生物过程，参与调控多种癌症发生，也与胃癌进程相关。研究发现过表达miR-146a-5p 在非小细胞肺癌中起抑癌作用。人参皂苷Rh2 通过上调miR-146a-5p 抑制肝癌细胞增殖，诱导细胞凋亡。高腹膜转移潜能的胃癌细胞中miR-146a-5p 下调表达。然而miR-146a-5p 对胃癌细胞增殖和凋亡的影响尚未清楚。本研究自2018 年3 月至2019 年3月研究山楂多糖提取物对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制及与miR-146a-5p的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

胃癌细胞AGS 购自中国科学院上海细胞库；RPMI-1640 培养基购自美国Gibco 公司；四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）试剂盒、Annexin V-FITC/PI 试剂盒购自日本同仁研究所；蛋白提取试剂盒购自美国Epigentek 公司；Trizol 试剂、荧光定量试剂盒购自美国Progema公司。

1.2 方法

1.2.1

山楂多糖提取物的制备 山楂购自本地大型超市，将山楂洗净后切片、烘干，按料液比1∶20的比例加入蒸馏水后打浆，90 ℃热水浴提取6 h，加入0.1%的果胶酶45 ℃提取3 h，于80 ℃下灭酶10 min，离心收集上清液并浓缩，将浓缩液用95%的乙醇醇沉，离心收集沉淀，将沉淀复溶于水中，再次醇沉，离心收集沉淀，置于烘箱中烘干至恒重，得山楂多糖提取物。

将所得提取物经苯酚-硫酸法检测其为多糖提取物；将该粗多糖提取物加入胰蛋白酶于65 ℃孵育2 h，离心后去除沉淀，得到脱蛋白的多糖溶液；将其转移到层析袋中进行反复透析48 h，然后离心、浓缩、醇沉，得到半纯品；再将半纯品多糖用Sephadex G-100 凝胶柱层析，得纯多糖提取物。然后检测多糖含量。

制作标准曲线：称取4 mg葡萄糖溶于100 mL纯水中，分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 补水至1.0 mL，然后加入5%苯酚1.0 mL 和浓硫酸0.5 mL，摇匀，静置20 min 后检测490 nm 处吸光度值，以水为空白对照做同样显色处理。横坐标为吸光度值，纵坐标为糖含量。取1.0 mL 的多糖溶液按上述步骤操作，测吸光度值，以标准曲线作测多糖含量。用高效液相凝胶色谱法检测多糖纯度。

1.2.2

细胞培养与分组 胃癌细胞AGS 用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养液培养，取对数生长期AGS 细胞，分别为200、400、800 μg/mL 的山楂多糖提取物处理，作为不同浓度山楂多糖提取物组；正常培养的细胞作为对照（NC）组；用800 μg/mL 的甘露醇处理作等渗对照，记为800 μg/mL 甘露醇组。将miR-146a-5p 过表达载体及阴性对照转染至AGS细胞中，作为miR-NC 组、miR-146a-5p 组；将miR-146a-5p 抑制剂及阴性对照转染至AGS 细胞后用浓度为800 μg/mL 的山楂多糖提取物处理，作为antimiR-NC+山楂多糖提取物组、anti-miR-146a-5p+山楂多糖提取物组。转染均按照Lipofectamine2000试剂盒进行操作。

1.2.3

MTT 检测细胞增殖率 细胞培养48 h，按试剂盒说明操作，用酶标仪检测490 nm 处吸光度（OD）值。

1.2.4

流式细胞仪检测细胞凋亡 收集培养48 h的细胞，按试剂盒说明操作，上流式细胞仪检测。

1.2.5

蛋白质印迹法（Western Blot）检测蛋白cyclinD1、cleaved-caspase-3、β-catenin 表达 提取细胞总蛋白，定量后取50 μg 进行SDS-PAGE，转至PVDF 膜，封闭后加入一抗4 ℃孵育过夜，加入二抗室温孵育2 h，暗室中曝光显影，定影，测定各组蛋白条带的灰度值，计算蛋白表达水平。

1.2.6

实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测miR-146a-5p 表达水平 提取细胞总RNA，合成cDNA，进行PCR 扩增，循环条件为95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延长30 s，共40 个循环；相对表达量采用2法计算。

1.3 统计学方法

实验数据经SPSS 20.0 分析，计量资料用x ± s 表示，两组间比较采用独立样本t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验，以P ＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度山楂多糖提取物对胃癌细胞AGS 增殖的影响

对照组胃癌细胞AGS 的增殖率为（100.10±10.02）%，200、400、800 μg/mL 山楂多糖提取 物 组 分 别 为（85.12±8.51）%、（68.22±6.82）%和（42.11±4.21）%，与对照组相比，200、400、800 μg/mL山楂多糖提取物组胃癌细胞AGS 的增殖率降低（F=31.314，P ＜0.05）。

图1 不同浓度山楂多糖提取物对胃癌细胞AGS凋亡的影响：A为细胞凋亡流式图；B为cleaved-caspase-3蛋白表达印迹图

2.2 不同浓度山楂多糖提取物对胃癌细胞AGS 凋亡的影响

与对照组相比，800 μg/mL 甘露醇组AGS 细胞的凋亡率、cleaved-caspase-3的表达水平无显着变化；而不同浓度山楂多糖提取物组胃癌细胞AGS 凋亡率升高，cleaved-caspase-3 表达水平升高（P ＜0.05）（图1，表1）。

表1 不同浓度山楂多糖提取物胃癌细胞AGS凋亡的影响（n=3）/x ± s

2.3 山楂多糖提取物对miR-146a-5p 表达的影响

与对照组相比，山楂多糖提取物组胃癌细胞AGS 中miR-146a-5p 表达水平升高［（1.00±0.10）比（2.89±0.29），t=10.672，P ＜0.05］。

2.4 高表达miR-146a-5p 对胃癌细胞AGS 增殖和凋亡的影响

与miR-NC 组相比，miR-146a-5p 组胃癌细胞AGS 中miR-146a-5p 表达水平升高，cyclinD1表达水平降低，AGS细胞的增殖率降低，AGS细胞中cleaved-caspase-3表达水平升高，AGS细胞的凋亡率升高（P ＜0.05）（图2，表2）。

图2 高表达miR-146a-5p对cyclinD1、cleaved-caspase-3蛋白表达的影响

2.5 低表达miR-146a-5p 可以部分逆转山楂多糖提取物对胃癌细胞AGS 增殖和凋亡的影响

与anti-miR-NC+山楂多糖提取物组相比，anti-miR-146a-5p+山楂多糖提取物组胃癌细胞AGS 中miR-146a-5p表达水平降低，cyclinD1表达水平升高，AGS细胞的增殖率升高，AGS细胞中cleaved-caspase-3表达水平降低，AGS 细胞的凋亡率降低（P ＜0.05）。见图3，表3。

表2 高表达miR-146a-5p对胃癌细胞AGS增殖和凋亡的影响（n=3）/x ± s

表3 低表达miR-146a-5p可以部分逆转山楂多糖提取物胃癌细胞AGS增殖和凋亡的影响（n=3）/x ± s

2.6 Wnt/

β

-catenin 信号通路相关蛋白的表达

与对照组相比，山楂多糖提取物组胃癌细胞AGS 中βcatenin 表达水平降低（P ＜0.05）；与anti-miR-NC+山楂多糖提取物组相比，anti-miR-146a-5p+山楂多糖提取物组胃癌细胞AGS 中β-catenin 表达水平升高（P ＜0.05）。见图4，表4。

图3 低表达miR-146a-5p对cyclinD1、cleaved-caspase-3蛋白表达的影响

图4 β-catenin蛋白的表达

表4 Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达（n=3）/x ± s

3 讨论

研究发现中医药在癌前病变、术前新辅助化疗、术后化疗、延长患者生存期等方面对治疗胃癌有较好疗效。山楂是一种纯天然的药食同源的植物果实，其提取物具有抗氧化和延长寿命作用。山楂黄酮提取物也能够有效地抑制癌细胞的生长。研究显示山楂原花青素提取物可抑制肝癌SMMC-7721 细胞增殖，促进细胞凋亡。山楂多糖提取物可诱导人结肠癌细胞凋亡。本研究显示，不同浓度山楂多糖提取物处理的胃癌细胞AGS中细胞增殖率降低，细胞凋亡率升高，cleaved-caspase-3表达水平升高。说明山楂多糖提取物可抑制胃癌细胞增殖，促进细胞凋亡。

研究表明miRNA 也参与调控癌症的进展，miR-146a-5p 在转移性前列腺癌组织中低表达，miR-146a-5p 过表达可诱导非雄激素依赖性前列腺癌细胞的凋亡。miR-146a-5p 过表达抑制非小细胞肺癌细胞的肿瘤发生和血管生成。本研究显示，高表达miR-146a-5p 后胃癌细胞AGS 的增殖率降低，凋亡率升高，说明高表达miR-146a-5p 可抑制胃癌细胞增殖，促进细胞凋亡。表明miR-146a-5p 在胃癌中起抑癌作用。还有研究发现隐丹参酮通过调控miR-146a-5p/表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）轴抑制非小细胞肺癌。本研究显示，山楂多糖提取物处理后，miR-146a-5p 表达水平升高，而低表达miR-146a-5p 部分逆转了山楂多糖提取物对胃癌细胞AGS 增殖和凋亡的影响。说明山楂多糖提取物可能通过上调miR-146a-5p抑制胃癌细胞增殖，促进细胞凋亡。

Wnt/β-catenin信号通路参与调控癌症达发生发展等过程，且与胃癌的进展有关。研究报道沉默β-catenin 可促进胃癌MGC-803 细胞凋亡，抑制其侵袭。汉黄芩素可通过抑制Wnt/β-catenin 信号通路抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移，并诱导细胞凋亡。本实验结果显示，山楂多糖提取物处理的胃癌细胞AGS 中β-catenin 表达水平降低，说明山楂多糖提取物可抑制Wnt/β-catenin 信号通路激活。而低表达miR-146a-5p 逆转了山楂多糖提取物对βcatenin 表达的抑制作用。说明山楂多糖提取物可能通过调控miR-146a-5p 进而调控β-catenin 的表达而影响胃癌细胞增殖和凋亡。

综上所述，山楂多糖提取物可能通过上调miR-146a-5p进而抑制Wnt/β-catenin信号通路激活而抑制胃癌细胞AGS 增殖，促进细胞凋亡。将可为中药多糖治疗胃癌提供了新思路。