赵永艳，刘莹莹，吴胜英
血管性痴呆主要继发于缺血性脑血管病，根据病因、病变脑组织的部位、起病的形式可分为急性血管性痴呆、亚急性或慢性血管性痴呆［1］。血栓脱落引起的栓塞、血液动力学改变或任何可导致颈动脉与椎-基底动脉供血不足均可造成大脑行为、记忆及认知功能区低灌注，导致脑组织缺血缺氧并最终使大脑功能全面衰退，造成血管性认知损害，表现为包括记忆、认知、情绪、行为等症状与体征改变的综合征，且这种获得性智能损害常持续数月或半年以上［2-3］。血管性痴呆与年龄增长呈正相关，故积极探讨其发病机制、寻找有效的治疗药物和方法意义重大。养血清脑颗粒具有活血通络、滋阴养血、平肝潜阳之功效，在临床治疗血管性痴呆等已有应用，可显着改善患者记忆、认知、情绪和行为能力［4］。目前有研究证实其主要通过增高5-羟色胺、脑源性神经营养因子和神经生长因子蛋白含量来改善临床症状［5-6］。但对反映疾病严重程度的血清S100B蛋白（S100B）和及脑功能恢复密切相关的血管内皮生长因子（VEGF）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）及β-连环素（β-catenin）的表达缺少相关研究。本研究起止时间为2019年2—6月，采用两血管阻断法制作大鼠血管性痴呆模型，每日用养血清脑颗粒灌胃治疗，观察其对脑海马CA1区VEGF、β-catenin和GFAP蛋白表达的影响，借此探讨可能机理，为临床用药提供实验依据。
1 材料与方法
1.1实验动物清洁级SD大鼠36只，雄性，体质量范围为165～175 g，购自湖北省医学实验动物繁育中心，饲养于十堰市太和医院科研中心标准实验室，实验动物生产许可证：SCXK（鄂）2016-0008，实验动物使用许可证：SYXK（鄂）2016-031。本研究符合一般动物实验伦理学原则，实验遵守3R原则，满足动物福利。术后常规饲养标准啮齿类动物饲料，自由进食、饮水。实验室湿度60%～75%，室温（22±2）℃，12 h/12 h明暗交替光照。
1.2仪器和试剂高效液相色谱仪购自上海彬合物资有限公司（UltiMate 3000型）；水合氯醛购自武汉博莱特化工有限公司；养血清脑颗粒购自天津天士力制药股份有限公司（批号0170822）；VEGF和S100BELISA试剂盒由上海仁捷生物科技有限公司提供；兔抗大鼠β-catenin多克隆抗体由北京博奥森生物公司提供；DAB和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）低分子质量标准蛋白显色液由北京中杉生物有限公司提供；5-羟色胺标准品购自Aladdin；色谱纯乙腈、甲醇、甲酸（Thermo Fisher Scientific）；ELISA试剂盒由北京华英生物技术研究所提供。
1.3血管性痴呆模型制备及纳入标准模型制备参照刘伟等［7］两血管阻断法建模：造模前适应性饲养1周。将其中24只于手术前用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，待动物麻醉后，仰卧位固定四肢和头部，剪去颈部鼠毛并消毒，切开颈部皮肤，分离双侧颈内动脉，后用动脉夹将大鼠双侧颈总动脉夹闭10min后再通10 min，反复3次即可缝合伤口［7］。纳入标准：大鼠术后2 h左右会清醒，以行走向一侧倾倒、转圈，静止和提尾时向一侧前肢蜷曲，Zea Longa神经行为学评分［8］在1～4分之间为入选标准，评分为0和5分的弃去。本实验无动物死亡，24只均成模。
1.4分组及治疗方法先将养血清脑颗粒配制成6.4%的混悬液备用。然后将经以上两血管阻断法制作的24只血管性痴呆模型采用随机数字表法分为模型组和实验组（n=12），另12只未手术的设为对照组，对照组不进行建模手术。实验组在术后1周时皮肤均愈合，每天按20 mL·kg−1·d−1剂量，分2次灌胃给予6.4%的养血清脑颗粒混悬液，治疗3周，模型组和对照组灌等体积生理盐水对照，模型组和对照组灌等体积生理盐水对照。
1.5检测指标及方法
1.5.1Morris水迷宫实验 治疗3周后用WMT-100型Morris水迷宫分析系统进行定位航行试验测试逃避潜伏期，空间探索实验测试60 s内穿越平台次数，结合Zea Longa神经行为学评分评定大鼠学习和记忆能力。
1.5.2血清S100B检测方法 治疗3周后，分别断尾，取0.2 mL尾静脉血备用，采用免疫吸附法检测静脉血清S100B蛋白含量。
1.5.35-羟色胺检测方法 检测前配制人工脑脊液（氯化钠7.247 g，氯化钾0.224 g，氯化钙0.222 g，硫酸镁0.493 g，碳酸氢钠2.184 g，葡萄糖0.6 g，磷酸二氢钠0.193 g，溶于蒸馏水1 000 mL），通95%氧气+5%二氧化碳饱和后置于4℃冰箱备用。Morris水迷宫实验结束后，将大鼠断头处死，迅速分离出脑组织，放入人工脑脊液中，小心分离出海马CA1区组织冻存。检测时取出，室温解冻，取200μL水与甲醇混合液（比例为1∶1），将标本放入、振荡、匀浆、瞬离，抽取组织匀浆上清液100μL于离心管，加入200μL乙腈后涡旋（5 min），高速离心5 min（4℃，14 000 r/min），取上清加样检测，采用高效液相色谱-质谱技术（HPLC-MS）法检测脑组织海马CA1区组织中5-羟色胺含量。
1.5.4免疫组化 取冻存脑组织，石蜡包埋，切片，烤干，脱蜡，采用ELISA放射免疫方法检测脑组织VEGF含量；切片经免疫组织化学染色后检测GFAP和β-catenin蛋白阳性表达。免疫组化方法严格按试剂说明书具体操作步骤按进行。GFAP和βcatenin蛋白免疫组化阳性标准：光学显微镜下，细胞胞浆和胞核均呈棕黄色。组织切片采用摄像显微镜摄像，选择各组大鼠海马CA1区不重叠的6个视野，应用数码医学图像分析系统分别进行GFAP和β-catenin阳性细胞计数。
1.6统计学方法采用SPSS19.0软件进行统计学处理。以±s表示计量资料，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用SNK-q检验。因Zea Longa评分和VEGF不满足方差齐性假设，多组间两两比较采用非齐性条件下的Games-Howell检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1大鼠空间探索试验、定位航行及ZeaLonga评分比较除Zea Longa评分不满足方差齐性分析外，其他检测值均满足方差齐性。其中在Morris水迷宫空间探索试验中，模型组大鼠在撤去平台60 s时间内跨越平台次数明显减少，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。在定位航行试验中，模型组逃避潜伏期明显延长，Zea Longa行为学评分分值提高，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。实验组大鼠则相反，其60 s时间内跨越平台次数明显增多、逃避潜伏期明显缩短，Zea Longa评分较模型组明显降低，与模型组比差异有统计学意义（P<0.05）。因Zea Longa评分不满足方差齐性假设，采用非齐性条件下的Games-Howell检验，结果显示任意两组之间均差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
表1 大鼠空间探索试验、定位航行及Zea Longa神经行为学评分比较/±s
表1 大鼠空间探索试验、定位航行及Zea Longa神经行为学评分比较/±s
注：①与对照组比较，P<0.05。②与模型组比较，P<0.05。
组别对照组模型组实验组F值P值鼠数12 12 12穿台次数/次6.05±0.27 2.92±0.14①5.75±0.39①②440.38<0.001逃避潜伏期/s 41.24±3.49 86.95±6.34①42.57±3.20①②388.56<0.001 Zea Longa/分0.04±0.00 3.84±0.31①1.91±0.21①②904.13<0.001
2.2大鼠所测各项指标比较除CA1区VEGF不满足方差齐性外，其他检测值均满足方差齐性。其中模型组血清S100B及脑海马CA1区GFAP蛋白表达均增多、脑海马CA1区5-羟色胺含量降低，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05），脑海马CA1区VEGF、β-catenin蛋白表达增多，但与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）；而治疗后实验组S100B和GFAP蛋白明显降低，5-羟色胺含量及CA1区VEGF和β-catenin蛋白表达均增多，与模型组相比差异有统计学意义（P<0.05）。因CA1区VEGF不满足方差齐性假设，采用非齐性条件下的Games-Howell检验，结果显示对照组与实验组、模型组与实验组之间的差异有统计学意义（P<0.05），对照组与模型组之间差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。
表2 大鼠各项指标比较/±s
表2 大鼠各项指标比较/±s
注：S100B为血清S100B蛋白，GFAP为胶质纤维酸性蛋白，β-catenin为β-连环素，VEGF为血管内皮生长因子。①与对照组比较，P<0.05。②与模型组比较，P<0.05。
组别对照组模型组实验组F值P值鼠数12 12 12 S100B/（mg/L）2.41±0.21 5.29±0.37①2.85±0.34①②297.22<0.001 5-羟色胺/（μg/L）0.74±0.09 0.51±0.05①0.73±0.09②33.03<0.001 GFAP/（个/高倍视野）10.84±0.89 35.53±2.18①21.45±1.49①②712.27<0.001 β-catenin/（个/高倍视野）9.97±1.09 10.08±1.20 12.40±1.56①②13.37<0.001 VEGF/（mg/L）150.59±7.53 151.82±7.35 193.25±16.34①②56.19<0.001
3 讨论
现代医学研究认为，血管性痴呆与神经递质5-羟色胺、多巴胺等有关，因其是中枢神经系统重要神经递质，对高级神经功能具有重要调节作用，其在神经元含量下降可导致学习记忆障碍［9］。在本实验中模型组脑海马CA1区5-羟色胺含量低于对照组，大鼠平均逃避潜伏期明显延长，跨越平台次数减少，Zea Longa评分也明显高于对照组。这一方面提示血管性痴呆建模成功，同时也证实脑海马CA1区5-羟色胺含量降低影响到学习记忆功能。有研究表明，脑组织缺血与血管性痴呆的发生发展密切相关，脑组织缺血低氧性低灌注会直接或间接损伤海马区神经元，引起脑海马CA1区神经元损伤甚至突触丢失，从而导致学习和记忆功能障碍［10］。Wnt/β-catenin信号通路参与神经元的发育，而β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路的重要调节因子，调节DNA转录和细胞核内靶基因的表达［11］。血管新生对脑损伤修复起到促进作用，而VEGF是促进血管新生的主要调节因子，通过调节受损血管内皮细胞的迁移和增殖，从而改善血管内皮细胞功能、修复受损神经元［12］。因此，通过干预β-catenin和VEGF等调节因子可能影响血管性痴呆病理过程。本实验中模型组脑海马CA1区VEGF和β-catenin蛋白表达均低于正常对照组，说明夹闭大鼠双侧颈总动脉造成脑组织缺血而导致脑损伤，进而导致大鼠学习记忆功能障碍。而治疗后，实验组CA1区VEGF和β-catenin蛋白表达均增多，提示养血清脑颗粒能诱导血管性痴呆模型大鼠VEGF和β-catenin的表达。S100B蛋白主要分布于中枢神经系统中的树突胶质细胞、星形胶质细胞和室管膜细胞，大量临床检测发现，脑卒中患者血清S100B蛋白浓度明显提高，而高浓度的S100B参与神经退化的过程，产生的神经毒性作用可导致脑组织对缺血缺氧的敏感性增加，加剧神经元损伤及凋亡的风险，而经治疗后S100B蛋白则显着下降，说明S100B蛋白浓度变化与痴呆患者病情严重程度呈正相关［13］。另外，血管性痴呆与星形胶质细胞功能有关，而GFAP是星形胶质细胞的特征性标志物，故其在脑组织中表达可直接反映星形胶质细胞活化与增生状况［14］。本实验结果显示，模型组血清S100B及脑海马CA1区GFAP蛋白表达均增多，学习记忆能力的降低（大鼠平均逃避潜伏期明显延长，跨越平台次数减少，Zea Longa评分也明显高于对照组）；而治疗后实验组S100B和GFAP蛋白明显降低，这一结果与董静等［14］研究结果高度一致，这可能是养血清脑颗粒通过抑制星形胶质细胞活化、增生而发挥其对血管性痴呆的治疗效应。
中医学将血管性痴呆归属“痴证、善忘、不慧、愚痴、神呆”之范畴，表现为与智力有关的脑功能全面衰退为主的综合症候群［15］。现代中医将血管性痴呆分为肾虚髓亏、肝肾阴虚、瘀阻清窍、痰蒙清窍、心肝火旺、气虚血瘀、心脾两虚等七种基本证型，其中以肾虚髓亏贯穿整个血管性痴呆病程，其他证型兼并存在［16］。本研究认为，血管性痴呆具有本虚邪实的特点，病位以肾为主，其次为脑窍及心肝脾；病性以髓亏阴虚、气虚为主；病因以瘀血、痰浊为主。因肾主藏精生髓，肾精充盈则髓海得养，使人聪颖智慧；脑府失养、肾虚髓空则神情呆滞、反应迟钝而愚痴，因此，在治疗时应根据辨证分型有针对性地治疗。如肾虚髓亏者可益脑填髓、补益肝肾；气滞血瘀者可行气活血、化瘀开窍；气虚血瘀者当补气活血、通络开窍；心脾两虚者当健脾养心、开窍醒神；痰浊阻络者当健脾化痰、活血通络；肾阳虚衰型当温肾运脾、健脑醒神等，总之，血管性痴呆治疗宜以清热祛瘀、化痰开窍、益肝肾为总的治疗原则［17］。
“养血清脑颗粒”是以中医名方“四物汤”改良研制的复方中药制剂，由当归、川芎、白芍、夏枯草、钩藤、决明子、熟地黄、鸡血藤、珍珠母、细辛、延胡索等多味中药组成［18］。动物实验表明，养血清脑颗粒可显着改善血管性痴呆大鼠脑皮层微循环、增加痴呆大鼠脑血管血流量、抑制脑细胞凋亡、减轻缺血缺氧造成的缺血性脑损伤，明显改善血管性痴呆大鼠学习记忆能力［19］，本研究结果与其相符。养血清脑颗粒还可调节脑卒中大鼠血清中神经因子的含量，从而改善神经元的损害症状［20］。养血清脑颗粒具有补虚祛邪、活血养血、平肝潜阳、标本兼治的药理特性，可调节神经递质5-羟色胺及多巴胺合成，还可松弛动脉平滑肌、扩张全身小动脉、降低脑血管阻力并改善脑血流状态，从而发挥降低神经功能缺损程度的作用，在治疗痴呆方面取得了一定的临床疗效［21-22］。从中医药理角度分析，养血清脑颗粒具有补益肝肾、益脑填髓的作用。方中当归具活血化瘀通络之功效，川芎主要成分川芎嗪和阿魏酸具行血中元气、善行于头面的药效，二者均具有扩张血管、抗血小板聚集及改善微循环的作用；白芍主要成分白芍总苷具有抗血栓形成、抗炎、镇痛、调节免疫等作用；另外，熟地黄补肾养血滋阴；珍珠母、决明子可平肝熄风止痉。鸡血藤可补肝肾、益精壮阳，具有促进造血功能、免疫调节、抗炎、抗氧化、镇静催眠等药理作用；珍珠母主平肝潜阳、安神、定惊明目；夏枯草清热泻火、明目，可散结消肿；细辛解表散寒、祛风止痛、通窍、温肺化饮；延胡索活血、利气、止痛，可行血中气滞、气中血滞。以上诸药组成养血清脑颗粒方剂，在治疗血管性痴呆上可起到补虚祛邪、养血滋阴、补益肝肾、活血通络、平肝潜阳、益脑填髓的作用，使脑窍得以保养，学习记忆能力提高，智力和运动功能得以部分恢复。实验组60 s时间内跨越平台次数明显增多、逃避潜伏期明显缩短，Zea Longa评分较模型组明显降低，证实经养血清脑颗粒治疗，大鼠学习记忆能力提高。
综上所述，本实验从血管活性物质、神经递质和行为学等方面入手，结合养血清脑颗粒方剂中药药理作用，全面考察了养血清脑颗粒对血管性痴呆大鼠的治疗作用。从实验结果来看，养血清脑颗粒可能通过上调β-catenin蛋白、促进VEGF和5-羟色胺合成、降低GFAP、改善脑组织血流状态来发挥对血管性痴呆的治疗作用。
