王晓杜，赵凡凡，，代 兵，邵东华，蒋春英，周 圻＊，马志永＊
（1.浙江农林大学动物科技学院，临安300311；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）
病毒复制子指完全或部分去除病毒结构蛋白基因，保留与复制相关的非结构蛋白基因的病毒亚基因组，该亚基因组具有自主复制并表达病毒自身非结构蛋白及插入的外源蛋白质的能力，但是不包装出具有感染性的病毒粒子。病毒复制子不仅是研究病毒基因结构与功能技术平台，也是表达外源蛋白质［1］及研发疫苗的新型手段［2］。目前报道已经构建成功的复制子有甲病毒、小RNA病毒、黄病毒、冠状病毒等RNA病毒的复制子，其中研究最为成熟的是甲病毒复制子，已作为真核表达载体研制成功，并且进行商业化生产。虽然以甲病毒复制子为基础的新型疫苗能较好的产生免疫力，保护动物免受感染［3］，然而甲病毒复制子对细胞毒性较强而导致细胞很快发生凋亡，所以其不能持续表达外源蛋白质。黄病毒复制子能克服上述缺点，主要表现在以下几个方面：由于黄病毒复制子细胞毒性很小，能在细胞内复制数十天；另外黄病毒属病毒的RNA聚合酶保真性较高而保证黄病毒属病毒复制子作为疫苗载体时免疫原性较稳定；黄病毒属病毒复制子的RNA相对较小，便于遗传操作［4］。因此，黄病毒属病毒复制子的研究将在基础研究和疫苗开发研究方面极具价值。
猪日本乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）是黄病毒科（Flaviviridaefamily）黄病毒属（Flavivirus）重要的成员之一，同属病毒还包括黄热病毒（yellow fever virus，YFV）、蜱传脑炎病毒（tick－borne encephalitis virus，TBEV）和登革热病毒（Dengue virus，DENV）等。JEV 病毒粒子直径约50nm，病毒基因组为单股正链RNA，长约11 kb，包含一大的开放阅读框，合成一条长的肽链，在细胞内蛋白酶的作用下，合成病毒的结构蛋白（C）、基质蛋白（prM）、囊膜蛋白（E）和7个非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B，NS3，NS4A，NS4B，NS5）［5］。JEV基因组5′端有I型帽子结构（m7GpppAmp），3′端不携带多聚腺苷酸尾。基因组5′和3′末端核苷酸都可形成高度保守的二级结构，其与病毒的复制密切相关［6］，NS3、NS5基因编码的复制酶复合体对病毒基因组复制和蛋白质翻译是必须的。作者通过改造本课题组前期构建的JEV弱毒株SA14－14－2感染性克隆，去除其部分结构基因（prM及E），构建以CMV为启动子的JEV复制子载体pAC－JEV，插入外源基因，验证该载体具有自主复制能力和外源蛋白质表达效果，为开发新型疫苗和研究JEV的复制机制提供技术基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
含有JEV疫苗株SA14－14－2的基因片段质粒pK－JEV由作者实验室提供；质粒pBluescript SK2（＋）、pcDNA3.1（＋）、pEGFP－N1、低拷贝质粒pACYC－177由作者实验室保存；小鼠抗JEV多克隆抗体由作者实验室制备。
主要试剂：RT－PCR试剂盒、rTaq酶、限制性内切酶购自 TaKaRa公司；Lipofectamine 2000、FITC－羊抗小鼠IgG、HRP－羊抗小鼠酶IgG、各种血清和细胞培养用培养基购自Invitrogen公司；质粒提取试剂盒、DNA片段胶回收试剂盒、DNA片段快速纯化试剂盒购自Xygen公司；常规试剂为国产分析纯。
1.2 含CMV启动子的JEV复制子载体pAC－JEV的构建
JEV复制子载体pAC－JEV、NS5缺失载体pAC－JEV－△NS5的结构如图1。构建方法如下：以低拷贝质粒pACYC－177为骨架，引入新的酶切位点（HindⅢ －EcoRⅠ－KpnⅠ－SalⅠ－XbaⅠ－XhoⅠ），将CMV启动子插入新引入的酶切位点HindⅢ－EcoRⅠ间；之后分别将JEV结构蛋白C基因、FMDV 2A插入EcoRⅠ和KpnⅠ酶切位点间，命名该质粒为pAC－CMV－CF2A；再以pK－JEV为模板，用NSⅠ－F及NSⅠ－R扩增JEV非结构蛋白NSⅠ，用NSⅡ－F及 NSⅡH－R1／R2／R3采用延伸PCR方法获得NSⅡ＋HDVRz融合片段，将2个片段保存于－20℃备用。利用XbaⅠ和XhoⅠ将NSⅡ＋HDVRz连接到pBluescript SK2（＋）上并命名为pBlue－NSⅡ＋HDVRz，以NheⅠ和XhoⅠ为酶切位点将polyA连接到pBlue－NSⅡ＋HDVRz，连接产物鉴定正确后经XbaⅠ和XhoⅠ双酶切再连接到pAC－CMV－CF2A 上，将其命名为 pAC－exJEV，最后利用SalⅠ和XbaⅠ将NSⅠ连接到pAC－exJEV上，将最终的复制子载体命名为pAC－JEV。为了证明pAC－JEV的自主复制能力，利用突变PCR的方法，使得pAC－JEV的NS5基因缺失，构建pACJEV－ΔNS5质粒。扩增相关序列引物见表1。
表1 扩增引物序列Table 1 Primers for constructing the subgenomic replicon of JEV
1.3 转染BHK－21细胞
利用pAC－JEV质粒，将质粒（2μg）转染BHK－21细胞，具体方法参照Lipofectamine 2000说明书。通过方阵试验确定质粒与脂质体用量的最佳比值，之后将质粒染至24孔板单层BHK－21细胞，以pACYC－177空质粒为阴性对照。
1.4 含EGFP报告基因复制子的构建及表达检测
以pEGFP－N1为模板，设计合成两条引物EGFP－F／R（表1），PCR 扩增获得EGFP基因，利用KpnⅠ和SalⅠ双酶切与pAC－JEV、pAC－exJEV相连接并命名为 pAC－JEV－EGFP、pAC－exJEV－EGFP，测序验证后，Lipofectamine 2000转染 BHK－21，同时以空载体pACYC－177为阴性对照，并在转染后12h开始，每隔24h在荧光显微镜下观察荧光变化。
1.5 Real－time PCR检测复制子中EGFP 的转录能力
重组载体pAC－JEV－EGFP、pAC－exJEV－EGFP分别转染BHK－21细胞，转染后24、48、72、96h收取细胞样品提取RNA，经DNaseⅠ消化后取1μg总RNA进行反转录PCR反应。荧光定量PCR检测EGFP基因片段引物序列，F：5′－AAGCAGAAGA－ACGGCATCAAGG－3′；R：5′－CACGAACTCCAGCAGGACCATG－3′。对每个样品设定3次重复，以GAPDH作为内参基因，相对定量方法计算其RNA量的相对转录量。
1.6 IFA和Western blotting检测复制子非结构蛋白的表达
将细胞传代于放置盖玻片的30mm细胞培养皿中，细胞长至90%时转染pAC－JEV质粒4μg。分别于转染后24、48、72h收取相应时间点的盖玻片，阴性对照和阳性对照72h收取。IFA操作过程：细胞片经甲醇∶冷丙酮（1∶1）－20℃固定20 min，PBS洗涤3次，1%BSA 37 ℃封闭30min，PBS清洗3次，每次10min；用1∶50稀释的小鼠抗JEV多抗37℃孵育1h，PBS洗5次，每次10min；用1∶500稀释的FITC－羊抗小鼠IgG为二抗37℃孵育30min，TBS洗3次，每次10min；1×DAPI室温染色10min，TBS清洗3次之后用封片剂将盖玻片固定于载玻片上，荧光显微镜观察。
用 Lipofectamine 2000 转 染 pAC－JEV、pACJEV－△NS5（图1）、pACYC－177、pAC－JEV－HA、pAC－JEV－GP5质粒至30mm 内BHK－21细胞中，以感染JEV细胞为阳性对照，正常细胞为阴性对照。72h收取细胞样品，离心沉淀细胞。裂解液和超声破碎提取细胞总蛋白质，BCA法测蛋白质浓度。取20μg总蛋白质进行SDS－PAGE电泳，之后将蛋白质电转至NC膜进行 Western blotting。将NC膜在小鼠抗JEV NS3（1∶1 000稀释）多抗中4℃孵育过夜，TBST洗5次，每次5min；羊抗小鼠HRP酶标记的二抗（1∶5 000稀释）室温孵育1h，TBST洗3次，每次5min，ECL试剂盒进行显影，并把显出来的胶片进行计算机扫描，保存和编辑图片。
图1 复制子及相关载体结构示意Fig.1 Schematic diagram of construction of the subgenomic replicon vector
2 结 果
2.1 JEV复制子相关载体pAC－exJEV、pAC－JEV、pAC－JEV－△NS5、pAC－JEV－EGFP、pAC－exJEV－EGFP、pAC－JEV－HA 和GP5、pAC－JEV－△NS5－HA 和GP5的构建
将CMV启动子、HDVRz、PolyA终止子等元件引入质粒pACYC－177中，在课题组此前构建的JEV感染性克隆的基础上，去除JEV结构蛋白prM和E，构建了保留全部非结构蛋白的JEV复制子载体pAC－JEV（图1）。为方便后续试验的对照，再通过PCR方法缺失掉NS5羧基端部分基因序列而构建的质粒pAC－JEV－△NS5（图1）。在pAC－exJEV和pAC－JEV复制子的基础上，利用KpnⅠ和SalⅠ酶切位点，引入GFP、HA、GP5基因，构建pACJEV－EGFP、pAC－exJEV－EGFP、pAC－JEV－HA、pAC－JEV－GP5质 粒，在 pAC－JEV－△NS5 的 基 础上，插入HA、GP5基因构建pAC－JEV－△NS5－HA、pAC－JEV－△NS5－GP5质粒。以上构建的质粒均通过酶切、测序鉴定无误后进行下一步试验。图1展示了部分质粒构建示意。
2.2 IFA验证复制子非结构蛋白的表达情况
将pAC－JEV转染至BHK－21细胞，分别在24、48、72h取出盖玻片，以小鼠抗NS3抗体为一抗，进行IFA检测。试验结果表明，24h时大多数细胞已经表达JEV的NS3蛋白（图2A），病毒蛋白质位于细胞质；随着时间的延长，荧光的亮度有所增加（图2A～C），说明JEV复制子具有自主复制能力。阳性对照组（JEV感染48h）几乎全部细胞都有较强的荧光信号（图2D）；而阴性对照组（转染pAC－exJEV质粒）细胞内无荧光信号（图2E）。该结果表明pAC－JEV复制子具有自我复制能力。
2.3 Western blotting 检测复制子 pAC－JEV 的非结构蛋白表达
载体pAC－JEV、pAC－JEV－ΔNS5分别转染BHK－21，同时设置阳性（JEV感染48h）、阴性对照组（空白的BHK－21细胞），转染96h后收取细胞样品进行 Western blotting，β－actin作为蛋白质样品上样量对照。结果表明：转染96h后，pAC－JEV复制子载体还能表达JEV NS3蛋白（图3），而对照的pAC－JEV－ΔNS5质粒转染的细胞中，由于NS5（JEV复制的重要酶）的缺失，复制子的亚基因组复制能力受阻，NS3也就无法进行表达。该试验进一步证明复制子pAC－JEV具有自我复制能力。
2.4 pAC－JEV－EGFP复制子表达报告基因EGFP
复制子载体pAC－JEV和带有报告基因EGFP的pAC－JEV－EGFP质粒各2μg，依据转染试剂盒说明书上的方法，利用Lipofectamine 2000，将质粒转染进BHK－21细胞，转染后每隔12h，将转染样品置荧光显微镜下观察一次，连续观察8d。结果显示：转染12h后即出现绿色荧光，该荧光可持续8d左右（图4），并且荧光亮度逐渐增加，但是由于细胞培养时间的延长，期间发现部分阳性细胞变圆死亡现象。该试验说明复制子载体pAC－JEV具有表达外源基因的能力。
2.5 Real－time PCR验证JEV复制子表达外源基因的能力
JEV 复制子 pAC－JEV－EGFP和 pAC－exJEVEGFP转染BHK－21细胞24、48、72和96h后，收集细胞提取细胞RNA，RT－PCR合成cDNA，Realtime PCR检测样品中的EGFP和β－actin转录水平。结果显示：JEV复制子转录GFP的RNA量随着转染时间的延长呈逐渐增长趋势，EGFPmRNA转录量在不同时间相对于阴性对照分别上升0.56倍（P＜0.05）、1.81倍（P＜0.01）、2.06倍（P＜0.01）和3.86倍（P＜0.01），而阴性对照组pAC－exJEV－EGFP中RNA的转录量几乎没有变化（图5）。该试验进一步说明复制子载体pAC－JEV具有表达外源基因的能力。
2.6 基于JEV复制子pAC－JEV的外源基因（GP5和HA）表达检测
为了验证JEV复制子表达外源基因的能力，携带猪繁殖与呼吸综合征病毒的GP5基因载体pACJEV－GP5和猪流感病毒HA基因载体pAC－JEVHA分别转染BHK－21细胞，设定转染pAC－JEV质粒样品为阳性对照，设定转染pAC－JEV－△NS5、pAC－JEV－△NS5－HA、pAC－JEV－△NS5－GP5 质粒样品作为每一组的阴性对照。分别利用小鼠抗GP5和HA抗体进行检测，小鼠抗JEV－NS3抗体作为JEV复制子的复制能力指示，β－actin作为蛋白质样品上样量对照。结果表明：GP5和HA都能在BHK－21细胞内表达，JEV复制子也能进行自主复制（图6）。该试验证明复制子载体pAC－JEV可以作为新型疫苗载体工具，开展多价疫苗的研究。
图2 间接免疫荧光检测JEV复制子载体非结构蛋白的表达（40×）Fig.2 Identification of the nonstructural protein expressed by subgenomic replicon vector pAC－JEV by indirect immunofluorescence assay（40×）
图3 Western blotting检测非结构蛋白NS3表达量Fig.3 Identification of expression level of the nonstructural protein by Western blotting
图4 复制子pAC－JEV－EGFP在BHK－21细胞的表达（40×）Fig.4 Expression of the EGFP protein by JEV subgenomic replicon vector pAC－JEV－EGFPin BHK－21cells at various times after transfection（40×）
图5 Real－time PCR检测复制子在细胞内RNA量的变化Fig.5 Detecting changes in amount of replicon RNA in cells by Real－time PCR
图6 携带外源基因GP5和HAJEV复制子在BHK－21细胞中的表达Fig.6 GP5and HA were expressed in BHK－21cells by JEV replicon vector
3 讨 论
病毒复制子作为能自主复制的病毒亚基因组，是研究病毒复制机制及研发新型核酸疫苗的理想工具。目前病毒复制子存在两种形式：DNA型复制子和RNA型复制子。目前已经构建成功的多个黄病毒都 是 RNA 复 制 子，如 WNV［7］、YFV［8］、Kunjing［9］、JEV［10－11］，虽然 RNA 复制子能成功进行 体外复制，但是它具有操作繁琐、不稳定等缺点，但是仍有 部 分 构 建 的 复 制 子 应 用 到 疫 苗 研 究［12－15］。DNA复制子采用CMV启动子和BGH poly（A）尾巴作为转录元件，无需进行体外转录、可直接转染细胞进行表达，并且能作为DNA疫苗直接进行免疫动物，在疫苗研究方面具有良好的应用前景。J.Li等将病毒复制子成功应用到甲病毒快速检测中［16］，这为病毒复制子应用拓展了新的思路。
JEV病毒为单股正链RNA病毒，其复制特点为非结构蛋白（组装成复制相关酶）可以完成病毒亚基因组的复制［6］，因此本研究利用该特点构建能自主复制的JEV复制子。本研究中作者以JEV弱毒株SA14－14－2感染性克隆为基础，构建了JEV的DNA型复制子表达载体，选用CMV为启动子、BGH poly（A）为终止子以保证复制子亚基因组的转录起始和终止，亚基因组中去除结构蛋白基因prM和E，避免病毒粒子的包装，降低生物安全风险。由于有文献报道结构蛋白C的完整性会对病毒的复制产生一定的影响［17］，因此本研究构建JEV复制子保留了结构蛋白C全基因序列，并在C基因序列的后面添加口蹄疫病毒的2A蛋白基因序列（FMDV－2A），其作用是利于细胞内的蛋白激酶将有效地分开结构蛋白C和后面多克隆位点插入的外源蛋白质［18］。本研究的复制子还保留E蛋白基因羧基端66个碱基，这段序列的存在保证了JEV NS1蛋白的正确剪切和加工［10］，同时也有利于病毒复制酶的正确切割和组合。为使JEV复制子亚基因组的3′端呈天然病毒RNA状态，在JEV 3′UTR后端添加丁肝病毒核酶（HDVRz）识别序列［19］，保证JEV复制子RNA的3′UTR的正确性，有利于相关酶的识别，从而保证复制子亚基因组的复制。
在本研究中，为了验证该复制子载体自主复制能力，利用NS3蛋白作为指示，间接免疫荧光和Western blotting检测，转染后24～96h，NS3表达逐渐增加。因为NS5蛋白是JEV关键的复制酶［20］，将其缺失后病毒无法进行自主复制，NS5蛋白基因缺失组（pAC－JEV－△NS5）无法检测到 NS3的表达。同时本研究也利用Real－time PCR检测了JEV复制子的NS3mRNA转录情况，结果也说明随着转染时间延长，复制子组NS3的mRNA转录水平逐渐增加（数据没有显示）。以上结果说明JEV复制子pAC－JEV具有自主复制能力。
JEV复制子具有持续表达外源蛋白质EGFP能力，并可以一直持续到8d以后（图4），国内外学者有相似的研究结果［10－11］，但是本研究所构建的复制子为DNA型复制子［CMV为启动子、BGH poly（A）为终止子］，具有来源简单（质粒来自大肠杆菌）、操作方便（不需要体外转录和RNA的纯化），表达外源蛋白质稳定，GP5和HA等其他病毒蛋白质也能表达（图6）。该特点将有利于研究开发多联疫苗，也为研究JEV复制机制提供新的工具。
4 结 论
基于JEV的SA14－14－2毒株成功构建DNA型复制子载体，各种不同方法证明该复制子pAC－JEV具有自主复制能力，在该复制子中插入外源基因GFP、GP5、HA，都能在细胞中表达，并且表达持续时间可达到8d以上，证明该复制子具有较强表达外源蛋白质能力。本研究构建的复制子将为研究JEV各病毒基因和蛋白质功能及复制子多价疫苗研究奠定了基础和提供新的工具。
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