李曼曼，温丙言，朱河水，钟 凯，杨国宇，王月影
(河南农业大学农业部动物生化与营养重点开放实验室，郑州 450002)
猪lipasin基因的克隆及其对肝细胞LPL基因转录的影响
李曼曼，温丙言，朱河水，钟凯，杨国宇，王月影*
(河南农业大学农业部动物生化与营养重点开放实验室，郑州 450002)
摘要：旨在克隆猪lipasin基因，并检测其对肝细胞LPL基因转录的影响。本试验利用同源电子克隆技术克隆猪lipasin基因，构建其真核表达载体转入肝细胞，探讨其对LPL基因转录的影响。结果表明，成功克隆了猪lipasin基因，目的片段大小为615 bp，上传至GenBank(登录号：KF017598)，开放阅读框为594 bp，编码197个氨基酸，liapsin蛋白的分子量和等电点分别为21.99 ku和6.79；成功构建了真核表达载体PB-EGFP-lipasin，实现lipasin基因在肝细胞中的过表达，与对照组相比，PB-EGFP-lipasin转染的细胞中LPL基因的转录水平显着下降。结果提示，猪lipasin可能通过抑制肝细胞LPL的转录影响脂代谢。
关键词：lipasin；猪；克隆；肝细胞；LPL
血管生成素样蛋白(Angiopoietin-like proteins，ANGPTLs)家族包括7个成员，分别为ANGPTL1～ANGPTL7，由7种不同的基因编码产生[1]。ANGPTLs结构包含氨基端分泌蛋白的信号肽、卷曲螺旋结构域和羧基端纤维蛋白原样结构域[1]，ANGPTLs的氨基端和羧基端结构域有不同的功能，ANGPTL3的氨基端卷曲螺旋结构域和羧基端纤维蛋白原样结构域分别参与脂代谢调节[2]和血管再生[3]。
脂蛋白脂酶(Lipoprotein lipase，LPL)是脂肪细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、乳腺细胞以及巨噬细胞等合成和分泌的一种糖蛋白，以同源二聚体形式保持LPL的活性。LPL可以将乳糜微粒和极低密度脂蛋白中的甘油三酯分解，为脂肪、肌肉和心等组织提供游离脂肪酸。LPL还参与极低密度脂蛋白和高密度脂蛋白间的载脂蛋白和磷脂的转换，载脂蛋白CⅡ的C端第61～79位氨基酸具有激活LPL的作用。LPL基因表达变化直接影响LPL功能，LPL基因表达异常能导致脂质代谢紊乱，影响机体正常的生命活动。
研究表明，ANGPTL3和ANGPTL4在脂代谢调节中发挥重要作用[4-6]。其作用机制为释放N端功能区，以可逆或不可逆的方式干扰LPL二聚体的形成，进而抑制LPL的活性。lipasin蛋白的结构与血管生成素蛋白家族相似，其结构中包含氨基端卷曲螺旋结构域和羧基端纤维蛋白原样结构域[7]，属于ANGPTLs中的一员。将lipasin与7种ANGPTL蛋白的氨基端结构域进行进化分析，发现lipasin与ANGPTL3亲缘关系最近[8]。ANGPTL3能抑制LPL酶活性在脂代谢调节中发挥作用，提示lipasin可能在脂代谢中发挥重要作用。研究表明，lipasin能抑制LPL的酶活性，从而降低体内甘油三酯的分解，升高血清中甘油三酯的含量[9-10]。lipasin是新发现的一个脂代谢调节关键因子[11]，有关猪lipasin基因的研究报道较少。本试验根据GenBank已公布的人和鼠的lipasin序列，应用同源电子克隆技术克隆猪lipasin基因，构建其真核表达载体转入肝细胞，探讨其对LPL基因转录的影响，为进一步研究猪lipasin基因在脂代谢调节中的作用奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
猪肝组织来自河南省开封市永康猪场，L-02肝细胞购自上海博谷生物有限公司。
1.2试剂与仪器
PB转座子载体质粒PB-CMV-Puro-EGFP(SBI公司)；限制性内切酶(PstⅠ、NheⅠ、EcoR Ⅰ)、T4 DNA连接酶(NEB公司)；质粒提取试剂盒、LA Taq酶、2×SYBR Master Mix、反转录试剂盒和SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa公司)；转染试剂Turbofect(Thermo公司)；DMEM培养基(Hyclone公司)、胎牛血清FBS(Gibco公司)；嘌呤霉素(Sigma公司)；E.coliDH5a感受态细胞(TaKaRa公司)；温度梯度PCR分析仪(Biometra公司)、荧光定量PCR仪(Eppendorf公司)。
1.3方法
1.3.1lipasin基因的克隆与鉴定根据GenBank公布的人和鼠的lipasin序列，应用同源电子克隆技术获得猪lipasin序列，利用软件Primer 5.0设计特异性引物，上游引物：5′-CCATGTCCACGC-TCATGCTG-3′；下游引物：5′-TTCTGCCCAAGCAGGCTCAG-3′，预期目的片段为615 bp，引物由TaKaRa公司合成。提取猪肝组织RNA，反转录合成cDNA，用LA Taq聚合酶扩增lipasin基因。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增目的片段并回收，将目的片段与pMD19-T载体连接，重组质粒命名为pMD19-lipasin，转化DH5α，进行蓝白斑筛选，挑选白色菌落进行扩大培养，提取质粒用PstI进行酶切鉴定(片段为192、304和2 812 bp)，将阳性结果送至上海生物工程有限公司进行测序。
1.3.2PB-EGFP-Lipasin真核表达载体的构建与鉴定设计带有酶切位点的引物，上游引物：5′-ACTGTCAGCATGTCCACGCTCATGCTGTG-3′,下游引物：5′-ACTGAATTCGGCCGGGAGTGCTGCCATG-3′(下划线分别为NheⅠ、EcoRⅠ酶切位点和保护碱基)；以测序正确的质粒pMD19-lipasin为模板，用LA Taq聚合酶扩增带有酶切位点的lipasin基因。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收目的片段。
将带有酶切位点的lipasin片段和PB-EGFP质粒分别用NheⅠ、EcoRⅠ进行双酶切，并用T4 DNA连接酶连接，重组载体转化DH5a，挑选克隆扩大培养，提质粒，命名为PB-EGFP-lipasin，将NheⅠ、EcoRⅠ酶切鉴定(片段大小为600和7 252 bp)正确的质粒送上海生物工程有限公司测序。
1.3.3细胞转染与筛选将冻存的L-02肝细胞复苏，用含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养。待细胞生长状态良好，按1×105个·mL-1消化接种于6孔板，继续培养至细胞融合度为80%～90%时，将PB-EGFP-lipasin和PB-EGFP质粒分别转染细胞，转染24 h后，用含3.0 mg·mL-1嘌呤霉素的培养基进行筛选，每24 h观察细胞的状态，筛选4 d后得到稳定表达的细胞株。将稳定表达lipasin(试验组)和转PB-EGFP质粒的肝细胞(阴性对照组)以1×105个·mL-1接种6孔板，待细胞融合度为80%～90%收集细胞，每组3孔，重复3次。
1.3.4Lipasin和LPL基因转录水平检测根据GenBank公布的猪甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、LPL的mRNA序列和本实验室提交GenBank的猪lipasin基因序列(登录号：KF017598)，利用软件Primer 5.0设计引物，引物序列见表1，由TaKaRa公司合成。利用Trizol法提取细胞总RNA，按照TaKaRa公司反转录试剂盒的说明书进行cDNA合成，采用荧光定量PCR法测定细胞中GAPDH、lipasin和LPL基因的转录水平。反应体系：2.5 μL cDNA，10 μL 2×SYBR®Premix Ex Taq，上下游引物各0.2 μL (20 μmol·L-1)，加水补齐至20 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40个循环。
表1PCR扩增反应的引物
Table 1The primers used in PCR amplification reactions
1.3.5荧光定量PCR数据分析以GAPDH基因作为内参基因，通过公式计算细胞中lipasin和LPL基因的转录水平：Ratio= EtargetΔCt target(control-sample)/ EreferenceΔCt ref (control-sample)，其中，Ratio为mRNA相对转录水平；Etarget为目的基因扩增效率；Ereference为内参基因扩增效率，Ctcontrol为对照组的Ct值，Ctsample为样品组的Ct值。对mRNA相对表达量采用Prism 6.0统计软件分析处理，组间采用学生t检验，*代表P<0.05，差异显着，**代表P<0.01，差异极显着。
2结果
2.1lipasin基因的克隆和鉴定
lipasin基因扩增结果见图1，在约615 bp处出现目的条带，与预期片段大小相符；质粒酶切鉴定结果见图2，在192、304和2 812 bp处出现目的条带，与预期片段大小相符；将酶切鉴定正确的质粒测序结果与电子克隆序列进行比对，且上传至GenBank(登录号：KF017598)。lipasin基因的开放阅读框大小为594 bp，编码197个氨基酸，liapsin蛋白的分子量和等电点分别为21.99 ku和6.79。
2.2真核表达载体PB-EGFP-lipasin的鉴定
真核表达载体PB-EGFP-lipasin的鉴定结果见图3。由图3可知，NheⅠ、EcoRⅠ双酶切后分别得到约600 bp的目的片段和7 252 bp的载体片段，与预期结果一致，提示真核表达载体PB-EGFP-lipasin构建成功。
2.3荧光定量PCR检测
荧光定量PCR检测结果见图4。由图4可知，样品中LPL、lipasin、GAPDH基因的熔解曲线均较集中，有单一的熔解曲线峰，基本上无杂峰出现，说明LPL、lipasin、GAPDH基因的扩增产物特异性较好。各基因在每个样品中的Ct值均不相同，说明不同样品中各基因的起始模板数不同。
2.4lipasin基因的转录水平
lipasin基因的转录水平见图5。由图5可知，空载体PB-EGFP转染细胞中未检测到lipasin基因的转录，PB-EGFP-lipasin转染的细胞中有lipasin基因的转录；与空载体PB-EGFP转染细胞相比，PB-EGFP-lipasin转染的细胞中lipasin基因的转录水平显着上升(P<0.01)。提示lipasin基因在肝细胞中实现了过表达。
2.5lipasin对LPL基因转录水平的影响
lipasin对LPL基因转录水平的影响见图6。由图6可知，与空载体PB-EGFP转染细胞相比，PB-EGFP-lipasin转染的细胞中LPL基因的转录水平显着下降(P<0.05)，即lipasin过表达后能使LPL基因转录水平下降。提示lipasin可能抑制LPL基因的转录。
3讨论
Lipasin是ANGPTL家族中的一个新成员，由肝产生后进入血液，调节血浆甘油三酯的水平，其分泌严格受机体营养水平的调控，禁食时肝和脂肪组织中的lipasinmRNA水平及血浆中的蛋白水平明显降低[12]。lipasin与ANGPTL3亲缘关系最近[8]，ANGPTL3能够抑制LPL的酶活性，进而在脂代谢调节中发挥作用，提示lipasin可能参与脂代谢的调节。lipasin基因突变与人的低密度脂蛋白和高密度脂蛋白血症密切相关。脂肪生成时诱导lipasin蛋白高表达，禁食或寒冷条件下lipasin和ANGPTL4的表达变化相反。敲除小鼠lipasin基因，血浆甘油三酯含量较低，当lipasin基因过表达时，甘油三酯水平显着提高[13]。推测lipasin在调控血浆甘油三酯水平和外周组织摄取脂肪酸方面发挥重要作用[14-15]。
肝作为营养物质代谢的中心，也是脂代谢的重要器官。研究表明，人的lipasin主要存在于肝组织中，小鼠的肝和脂肪组织中lipasin比较丰富，尤其是棕色脂肪组织[9]。有关猪lipasin基因的研究报道较少，本试验利用同源电子克隆技术获得猪lipasin基因序列，从肝组织中成功克隆lipasin基因，并且已上传至GenBank(登录号：KF017598)。lipasin基因开放阅读框大小为594 bp，编码197个氨基酸，liapsin蛋白的分子量和等电点分别为21.99 ku和6.79。
生理和病理状态下LPL活性与各器官组织的营养需要密切相关。小鼠和人的LPL功能异常会引起严重的高甘油三酯血症[16]。研究表明，lipasin能抑制LPL的酶活性，从而降低体内甘油三酯的分解，升高血清中甘油三酯的含量[9-10]，是新发现的一个脂代谢调节关键因子[11]。推测lipasin可能直接抑制了LPL活性，也可能通过促进ANGPTL3的剪切，暴露其N端结构域，进而抑制LPL的活性[17]。研究发现，lipasin和ANGPTL3共表达时，能使血浆中甘油三酯的含量提高10倍，提示二者可能存在协同作用[13]。本试验将构建的真核表达载体PB-EGFP-lipasin转入肝细胞，检测lipasin过表达后LPL的转录水平。结果发现，lipasin过表达能显着降低LPLmRNA水平，提示lipasin能抑制LPL的转录，为猪lipasin可能参与血浆甘油三酯的代谢调控提供了试验依据，真核表达载体PB-EGFP-lipasin的构建成功为进一步研究猪lipasin在脂代谢调控中的作用提供了技术支持和保障。
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(编辑郭云雁)
Cloning of PorcinelipasinGene and Its Effect onLPLGene Transcription in Liver Cell
LI Man-man，WEN Bing-yan，ZHU He-shui，ZHONG Kai，YANG Guo-yu，WANG Yue-ying*
(KeyLaboratoryofAnimalBiochemistryandNutritionofMinistryofAgriculture，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China)
Key words:lipasin；porcine；clone；hepatocyte；LPL
Abstract:The study aimed to clone thelipasingene and investigate its effects onLPLgene transcription in liver cell in pig.The porcinelipasingene was obtained by using homologous electronic cloning techniques and the eukaryotic expression vector was constructed and transfected into hepatocytes，and further to identify its effect on the transcription level ofLPLgene.The results showed thatlipasingene was successfully cloned，the segment size was 615 bp，it was deposited to GenBank with the accession number KF017598.The size of open reading frame (ORF) oflipasinwas 594 bp and it encoded 197 amino acids.The weight of lipasin molecular and theoretical isoelectric point were 21.99 ku and 6.79，respectively.The recombinant eukaryotic expression vector PB-EGFP-lipasin was successfully constructed and transfected into hepatocyte，realizing the overexpression oflipasingene.Compared with the control group，the transcription level ofLPLmRNA decreased significantly in PB-EGFP-lipasin transfected hepatocyte.These results suggest thatlipasinmay affect lipid metabolism by inhibiting theLPLgene transcription in hepatocyte.
doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.027
收稿日期：2015-03-18
基金项目：农业部“948”重点计划(2011-G35)；农业部转基因重大专项(2014ZX0801015B)；河南省重点科技攻关项目(112102310705)
作者简介：李曼曼(1989-)，女，河南许昌人，硕士生，主要从事动物生物技术方面的研究，E-mail：1065857330@qq.com *通信作者：王月影，副教授，硕士生导师，E-mail：wangyueying2008@126.com
中图分类号：S828；S813.3
文献标志码：A
文章编号:0366-6964(2016)02-0411-06
