新疆部分地区马疱疹病毒1型感染的血清学调查

胡 月，高雁怩，加尔肯，车传忠，王旭蕾，姜 平，冉多良*，刘建华

(1.新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052；2. 南京农业大学动物医学学院，南京 210095)

马疱疹病毒1型(equine herpesvirus-1， EHV-1)和4型(equine herpesvirus-4， EHV-4)是马鼻肺炎(equine rhinopneumonitis，ER)的病原体，这两种病毒均能引起马属动物呼吸系统疾病[1]。然而，EHV-1除了可以引起马匹呼吸系统疾病以外，还能导致孕马流产和新生马驹死亡及神经系统疾病，如马疱疹病毒髓脑病(equine herpesvirus myeloencephalopathy，EHM)，且其所致疾病的病发率和死亡率均较EHV-4高[2-3]。由于EHV-1是一种引起马匹不同临床综合征的病原体，给马产业造成严重的经济损失，2012年5月，世界卫生组织将EHV-1引起的疾病称为马疱疹病毒-1型感染(infection with equine herpesvirus-1)[4]，2020年7月，我国农业农村部、海关总署将该病列为二类动物传染病[5]。

然而，长期以来，我国的流行病学的研究重心一直放在马鼻肺炎病的调查与防控上，忽略了区分EHV-1与EHV-4感染[6-8]。2013—2017年，针对新疆地区的马鼻肺炎的流行病学调查显示各地区平均阳性率为15.16%～28.85%[9-13]。ER在新疆广泛流行，但却没有针对EHV-1开展的流行病学调查，对EHV-1的防控工作带来阻碍。为掌握新疆地区EHV-1的流行现状，本研究于2019—2020年研究采集新疆不同地区代表性马场的1 657份马血清样品，利用已建立的针对EHV-1 gG蛋白抗体的间接ELISA检测方法[14]，进行了血清学调查，并分析其流行特点和感染因素，为新疆马疱疹病毒1型感染的有效防控提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 样本

2019年6月—2020年7月，由新疆农业大学动物医学学院和部分地区兽医站从新疆乌鲁木齐、伊犁州、昌吉州和巴州的16处规模化养殖场采集纯血马、混血马、哈萨克马、伊犁马、焉耆马、普氏野马共1 657份血液样本，分批离心制备血清，于-80 ℃保存后集中检测。

1.2 试剂及仪器

TMB显色液和DAB试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；ELISA酶标板购自康为世纪公司；兔抗马IgG-HRP购自Abcam公司；其他常规试剂均为国产分析纯。酶标分析仪(Elx800)购自Bio-tek公司。

1.3 菌种、质粒及抗体

表达EHV-1 gG蛋白的阳性质粒pGEX-4T-1-gG，感受态表达菌E.coliBL21(DE3)，EHV-1感染马阳性血清、阴性血清均由新疆农业大学动物医学学院传染病实验室保存。

1.4 检测方法

将含有pGEX-4T-1-gG的阳性菌大量诱导表达后，用GSTrapTM HP kits纯化EHV-1 gG蛋白，并测定蛋白浓度。按照实验室已建立的间接ELISA方法进行样品检测，反应条件：抗原蛋白包被浓度为0.5 μg·mL-1；4 ℃过夜；50 g·L-1脱脂奶粉封闭，37 ℃ 2 h；待检血清1∶800稀释，37 ℃ 1 h； 二抗1∶1 000稀释，37 ℃ 30 min；加TMB显色液，37 ℃ 5 min；加1 mol·L-1H2SO4终止。每个样品同时设置3个平行对照，设阴阳对照。结果判定，样品OD450 nm值>0.307可判为阳性，OD450 nm值≤0.307可判为阴性。

1.5 数据统计与分析

运用SPSS 20.0进行统计分析，对不同品种、性别及年龄的马匹EHV-1感染阳性率采用卡方检测。

2 结 果

2.1 不同地区马血清马疱疹病毒1型感染抗体检测

来自16处规模化养殖场的1 657份血液样本含有544份阳性样品，平均阳性率为32.28%。乌鲁木齐7处规模化养殖场平均阳性率为39.34%(297/755)；伊犁州7处规模化场平均阳性率为22.56%(155/687)；昌吉州1处规模化养殖场阳性率为90.52%(86/95)；巴州1处规模化养殖场阳性率为5.00%(6/120)(表1)。其中，昌吉州某养殖场阳性率最高，乌鲁木齐次之，与伊犁州和巴州相比差异显着(P<0.05)。乌鲁木齐养殖场感染EHV-1存在城郊差异，县郊养殖场(乌鲁木齐县、达坂城区)44.05%(270/613)与乌鲁木齐市区养殖场(高新区、国有马场)19.01%(27/142)抗体阳性率差异显着(P<0.05)。伊犁州的不同乡镇的养殖场感染EHV-1存在差异，昭苏县阿克达拉镇阳性率最高，达48.28%(28/58)，尼勒克县阳性率最低，仅为0.9%(2/222)。表明EHV-1感染在新疆马群中存在地区差异。

表1 马血清来源及其EHV-1抗体检测结果

2.2 不同品种马血清EHV-1抗体检测

纯血马、混血马、哈萨克马、伊犁马、焉耆马、普氏野马的EHV-1抗体阳性率分别为20.34%、32.93%、44.92%、19.35%、5.00%、90.52%。其中，普氏野马血清的EHV-1抗体阳性率最高，显着高于其他品种的马(P<0.05)。焉耆马血清的EHV-1抗体阳性率最低，显着低于其他品种的马(P<0.05)(图1)。本土品种(哈萨克马、伊犁马、焉耆马)平均抗体阳性率为31.70%(305/962)，与引进品种(纯血马、混血马)25.50%(153/600)差异显着(P<0.05)；普氏野马90.52%(86/95)与家马29.32%(458/1562)的抗体阳性率差异显着(表2)。通过血清学检测初步表明不同品种马匹EHV-1抗体阳性率差异显着。

图1 不同品种马血清马疱疹病毒1型抗体检测结果Fig.1 The detection result of horse EHV-1 antibody in different breeds

2.3 不同性别、年龄马血清EHV-1抗体检测

统计(表2)表明，母马感染EHV-1的抗体阳性率为38.84%(414/1 066)显着高于公马22.00%(130/591)(P<0.05)，马匹感染EHV-1存在性别差异。16处规模化养殖场饲养的马匹年龄为0～15岁，可分为幼年(0≤Age≤1)、青年(1

3 讨 论

此次EHV-1抗体阳性率检测结果表明，2019—2020年新疆部分规模化马场EHV-1的平均阳性率为32.28%。新疆乌鲁木齐、伊犁州、昌吉州、巴州规模化养殖场普遍存在EHV-1感染，且不同地区、品种、性别及年龄的马EHV-1感染率差异显着(P<0.05)。其中，昌吉州某马场饲养的普氏野马发病率高达90.52%，该地区某养殖区于2019年5月 暴发马疱疹病毒1型感染，圈养95匹野马，其中，86匹野马体温升高至39.5～41.5 ℃，出现急性呼吸系统疾病， 6～7匹孕马流产。2匹野马死亡。86匹患马经血清学检测均为EHV-1抗体阳性，并经病毒分离鉴定确诊为EHV-1感染。普氏野马为国家一级保护动物，该物种具有6 000万年演化史，是研究家马起源和性状改良的不可或缺的材料[15]。此次，新疆昌吉州暴发该病为我国普氏野马的繁育与保护带来了严重危害，制约着该物种的健康发展和保存。制定合理的免疫程序，有效控制EHV-1在新疆的流行，对该珍贵物种的保存具有重大意义[16]。

表2 不同属性马匹感染EHV-1血清抗体检测结果

对乌鲁木齐的调查结果显示，县郊养殖场抗体阳性率(44.05%)显着高于市区养殖场(19.01%)。这与饲养环境及管理水平相关，县郊养殖场主要饲养哈萨克马，还包括混血马和伊犁马，多用于景区参观，而市区养殖场仅饲养纯血马，用于赛马和马术活动。由于引进马匹的经济成本较高，养殖场更注重饲养环境和消毒防疫工作，因而市区马场的饲养管理水平较县郊马场高[17]。此外，市区马场间隔较远，而县郊马场较为密集，不利于疫情防控[18]。提示当地应提高县郊马场的管理水平，降低饲养密度并做好疫苗接种工作。此次伊犁州7处规模化马场平均阳性率为22.56%，低于2017年袁贝等[13]对伊犁州10个乡镇的调查结果(28.85%)。其中，伊犁州新源县和尼勒克县阳性率为5.96%(18/302)，低于2016年杜润慈等[12]对两县的马鼻肺炎抗体检测结果(15.16%)。这可能与该地区EHV-4流行有关，本研究采用的EHV-1 gG蛋白抗体的间接ELISA检测方法可以有效区分EHV-1和EHV-4感染，因此，可以准确了解EHV-1感染情况。巴州焉耆县集中饲养的本地品种焉耆马EHV-1感染抗体阳性率仅为5%。焉耆马以群牧为主，因其具有持久耐劳的特性多用于马术比赛，当地政府也重视科学饲养和防疫程序，积极开展焉耆马养殖技术培训班，有效控制疫病传播[19]。

统计表明，母马EHV-1抗体阳性率(38.84%)显着高于公马(22.00%)，且养殖场的母马存栏量高于公马，应当对母马加强免疫预防该病。1岁以下马匹EHV-1抗体阳性率最高，其原因是5～6月龄马驹获得的母源抗体逐渐减少而自身免疫力较弱，与其他年龄阶段马匹相比更易于感染EHV-1[20-21]。研究表明，4～7月龄未断奶马驹及时进行疫苗接种可有效预防EHV-1感染，因而养殖场应重视对幼驹的预防接种工作[21]。

本研究通过对新疆部分地区规模化养殖场马匹的血清抗体检测，初步了解当前新疆地区EHV-1感染的流行情况，为该病的防控提供数据支持。分析结果提示，科学的饲养管理和严格的防疫工作可有效控制EHV-1在马群中的传播，养殖场应根据不同品种的马匹特性，给予其良好的生长环境；制定完善的免疫程序；对患马应及时隔离与治疗；加强跨区运输马匹EHV-1感染的监测工作。

4 结 论

通过对新疆乌鲁木齐、伊犁州、昌吉州、巴州规模化养殖场进行马疱疹病毒1型抗体检测，发现新疆地区普遍存在EHV-1感染，且不同地区、品种、性别及年龄的马匹EHV-1感染率差异显着(P<0.05)，可为新疆地区EHV-1感染的研究和防控工作提供调查数据。