黄启雪，张梦璐，张志锦，邢智洋，朱河水，王月影，付 彤，高腾云，韩立强

(河南农业大学动物医学院 农业部动物生化与营养重点实验室，郑州 450002)

在奶牛饲养中发现，高精料/低粗料日粮或饲粮中添加油脂都会造成牛乳中乳脂肪含量降低，形成低脂乳症现象(milk fat depression，MFD)。对此现象，前人在研究过程中提出了多个理论进行解释，如脂肪动员学说、乙酸不足学说、胰岛素-葡萄糖学说等。反式脂肪酸理论认为，是日粮在瘤胃氢化过程中产生的反式脂肪酸(trans-FA)导致了乳脂肪降低[1]，后来 Bauman 和Griinari[2]通过试验明确提出，油脂在瘤胃的代谢产物共轭亚油酸(conjugated linoleic acid，CLA)可以有效抑制乳腺脂肪合成。共轭亚油酸(CLA)是亚油酸的同分异构体，是一系列在碳9、11或10、12位具有共轭双键的高不饱和脂肪酸[3]。研究发现，给奶牛饲喂共轭亚油酸钙，或者肠道灌注 trans-10，cis-12 CLA[4-6]，会导致奶牛发生MFD，改变了乳中脂肪含量与脂肪酸组成，也调控了乳腺组织的基因表达，但对此过程的内在机理还存在很多未知之处。

乳脂肪以脂肪球(milk fat globule，MFG)的形式从哺乳动物的乳腺中分泌到乳中。每毫升牛乳中，大约有 150 亿个脂肪球，以大小不同的小液滴形状分散存在于乳中形成乳浊液。乳脂肪球颗粒直径大小从 0.2 μm 到 15 μm 不等[7]，主要受到动物种类[8]、遗传倾向[9]、泌乳时期[10]、季节和营养[11]的影响。研究发现，乳脂肪球的粒径大小与乳脂肪含量有显着相关性[12]，直接影响了乳品的营养特性和动物的肠道吸收，不同粒径的脂肪球还能够改变奶酪等下游乳产品的加工性质[13]。一些饲料营养因素可以改变脂肪球的直径，Argov-Argaman等[14]采用高精料日粮饲喂奶牛，发现脂肪球的平均粒径从 3.51 μm 减少到 3.3 μm。那么饲喂奶牛 CLA 造成乳脂肪含量减少的同时，是不是也伴随着脂肪球粒径大小的变化？这个问题目前还不清楚。因此，本研究通过在荷斯坦奶牛日粮中添加CLA，采用激光粒度仪检测其对乳脂肪球粒径大小及分布的影响，为从乳脂肪球角度阐明反式脂肪酸造成奶牛 MFD 的内在机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物和饲养管理

本试验选择24头泌乳中期荷斯坦奶牛，试验奶牛的日粮参照NRC(2001)中育成奶牛营养标准进行配制，日粮配方及营养成分见表1。试验所用奶牛在同一双列式牛舍内饲养，试验期间采用TMR日粮，按照自由采食，自由饮水的方式进行饲养。

1.2 试验分组

选取24头体型、身体状况、产犊日期相近的泌乳中期荷斯坦奶牛(体重(583±34.6)kg，产奶量(27.2±2.4)kg·d-1)随机分为4组，每组6个重复，每个重复1头牛，分别为对照组(C group)饲喂基础日粮(表1)，低剂量组(L group)每头饲喂基础日粮+150 g·d-1CLA；中剂量组(M group)饲喂基础日粮+300 g·d-1CLA；高剂量组(H group)饲喂基础日粮+400 g·d-1CLA。整个饲养周期为7 d，包括2 d适应期和5 d试验期，每天分别在07:00和16:00饲喂，每天挤奶3次。试验用共轭亚油酸微囊粉购自青岛澳海生物有限公司，其中分别含有cis-9，trans-11 CLA 39.6%和trans-10，cis-12 CLA 39.4%。

表1 奶牛基础日粮的成分和化学组成Table 1 Ingredient and chemical composition of the basal diets of cows g·kg-1 DM

1.3 样品采集

试验期间每天记录奶牛采食量和产奶量，试验期每天收集一次乳样，每头奶牛在早、中、晚按30∶40∶30取样后制成混合乳样，每天将50 mL混合乳样送至河南省奶牛生产性能测定中心采用乳成分分析仪(Foss 120 Milko-Scan，丹麦)进行乳脂、乳蛋白、乳糖含量的检测；在饲喂试验的第5天取中午的奶样，迅速将其送到实验室，采用激光粒度分析仪(Mastersizer 3000，英国)检测乳脂肪球粒径。

1.4 乳脂肪球染色观察

对鲜牛乳的脂肪球进行尼罗红染色。吸取1 mL 牛奶样品，加入4 mL超纯水进行稀释，加入1 mL 尼罗红染料(100 μg·mL-1)，混匀后避光反应20 min；取适量染色后的样品与琼脂糖(5 g·L-1)等量混合后滴到玻底皿中，用倒置荧光显微镜(OLYMPUS IX73，日本)观察。

1.5 乳脂肪球粒径分析

采用激光粒度分析仪检测新鲜牛乳样品的脂肪球粒径。根据Mastersizer 3000激光粒度分析仪的湿法指南进行操作，设置激光折射率(纯水=1.330，牛乳=1.560)，搅拌器速度2 000 r·min-1。向烧杯中加入400 mL水，然后将搅拌器放入烧杯中。单击开始按钮以初始化仪器和测量背景，然后将1 mL 的牛乳样品添加到烧杯中，直到激光度指示为10%～20%。系统将自动测量3次并计算平均值。使用Mastersizer软件对每个样品的获取值进行分析，生成数据包括体积相关直径D[4,3]，表面积相关直径D[3,2]，粒度分布图和粒度分布百分比。

1.6 统计分析

使用SPSS 25(SPSS / IBM Corp.，Chicago，IL)的通用线性模型(GLM)中重复测量方差分析CLA处理主效应对产奶量和采食量、乳成分的影响。采用单因素方差分析(one way ANOVA)比较CLA处理对脂肪球粒径及分布比例的影响。以P>0.05 表示差异不显着，P<0.05表示差异显着，P<0.01表示差异极显着。

2 结 果

2.1 乳脂肪球染色及粒径分布图

如图1A所示，乳脂肪球用尼罗红染色后显示红色荧光(图1A中发亮之处)，表明在牛乳中存在直径大小不一的脂肪球。牛乳的粒径分布如图1B所示，可以看出，乳脂肪球的粒径主要分布在1～10 μm之间。

图1 牛乳脂肪球染色(A)和粒径分布图(B)Fig.1 Milk fat globules staining(A) and particle size distribution diagram(B)

2.2 不同剂量CLA对奶牛生产性能和乳成分的影响

由表2可知，各组间的产奶量和采食量没有显着差异(P>0.05)；从乳成分的变化可以看出，CLA处理对乳糖和乳蛋白的含量没有显着影响，但随着CLA添加水平的增加，处理组牛乳中脂肪的含量极显着降低(P<0.01)。M组和H组的乳脂肪分别为 2.34 g·dL-1和2.23 g·dL-1，比对照组分别降低了34.82%和37.88%。

表2 CLA对奶牛生产性能及乳成分的影响Table 2 Effects of CLA on the production performance and milk composition of dairy cows

2.3 不同剂量CLA对脂肪球粒径大小和比例的影响

由表3可知，随着CLA添加剂量的加大，显着降低了处理组的乳脂肪球粒径(P<0.05)，其中，M组和H组的脂肪球粒径D[3,2]和D[4,3]均显着低于C组。进一步分析不同大小脂肪球占牛乳总脂肪球的比例发现，随着CLA添加剂量的增大，小脂肪球所占总百分比逐渐增加，而大脂肪球所占百分比逐渐减少(表4)。分布在1.54～2.58 μm 的小脂肪球，H组和M组的百分比显着高于C组和L组(P<0.05)，呈现出H组、M组>L组>C组的变化；分布在4.88～6.30 μm 的大脂肪球，H组和M组的比例显着低于C组和L组(P<0.05)，呈现出M组、H组

表3 CLA对牛乳脂肪球粒径的影响Table 3 Effects of CLA on the milk fat globule size

表4 CLA对不同粒径牛乳脂肪球比例的影响Table 4 Effects of CLA on the proportion of milk fat globules with different particle sizes

3 讨 论

研究发现，相较于小粒径MFG，粒径大的牛MFG含有的宿主防御蛋白含量更高，说明可以通过改变牛乳中MFG粒径来增强机体的保护功能[15]。MFG粒径也直接影响了下游食品加工中干酪成熟与乳制品保质期[16-17]。用小粒径MFG生产出的干酪具有较高熔点、较强弹性和较好的流动性等特点[18]。工业上均质化技术可以减小MFG的粒径差异，均质化后形成的脂肪球膜在物理和化学特性上也有较大差异[19-20]。本研究首次发现，泌乳期奶牛进行CLA处理，能够显着降低乳中脂肪含量和脂肪球粒径，并且改变了不同粒径乳脂肪球的比例，这对于生产富含小脂肪球的牛乳制品提供了应用基础。

对于CLA引起的低脂乳症已经进行过很多研究。Perfield等[21]连续140 d给奶牛饲喂CLA，Viswanadha等[22]在5 d内通过颈静脉将不同剂量CLA直接注射给奶牛，结果均发现，CLA只是特异性抑制乳脂肪合成，而对乳蛋白、乳糖和产奶量等奶牛生产指标没有显着影响，这与本试验的结果一致。这些结论支持了一个普遍的观点，即对于奶牛来说，有效剂量的CLA只会显着抑制乳脂肪合成而不影响其他乳成分。

脂肪在乳中以脂肪球(MFG)的形式存在，而脂肪球来源于乳腺上皮细胞内合成的胞浆脂滴(LD)[23]。

虽然对整个脂滴分泌过程还不是很了解，但目前研究认为，脂滴的分泌遵循这样的细胞机制：三酰甘油在乳腺上皮细胞的内质网合成后，体积逐渐增大，并在向质膜转运的过程中包裹磷脂和多种蛋白后形成脂滴，脂滴运输到细胞顶浆质膜，通过出胞过程分泌到乳汁中形成乳脂肪球[24-25]。本研究采用激光粒度仪检测发现，CLA的处理显着降低了乳脂肪的球直径，同时伴随着小脂肪球比例的增加和大脂肪球比例的减少。Altenhofer 等[26]已经发现了在乳脂肪含量与脂肪球直径之间的相关关系，结合本研究中CLA引起的脂肪降低，推测可能是饲喂CLA改变了奶牛乳腺分泌到乳中脂肪球的大小比例，引起了脂肪球平均粒径的减少，表现在乳成分上是乳脂肪含量的显着降低。

目前，CLA对于奶牛的作用机制主要认为是下调了乳腺脂肪合成基因的表达[27-29]，而本研究发现，CLA也会对脂肪球的大小产生影响。在乳腺上皮细胞中，细胞脂滴作为乳脂肪球合成的前体，脂滴在细胞内可以相互融合来形成大脂滴[30-31]；脂肪球的粒径会受到乳中磷脂的影响[32]。脂肪酸的饲喂能够影响奶牛的代谢[33]，因此，这种CLA引起的乳脂肪球粒径的变化，究竟是由细胞内的脂滴融合引起[34]，还是由乳腺分泌乳脂肪球本身所导致的，未来还需要更多深入研究。

4 结 论

本研究通过给奶牛饲喂CLA发现，乳脂肪发生明显降低，同时乳脂球直径D[3,2]和D[4,3]均显着降低，并且伴随着小脂肪球比例的增加和大脂肪球比例的减少。