尤桂爽，易兴友，蒋美山，李中伟，谭和林，曹 池，舒 刚，田尧夫，朱 庆，赵小玲*
(1．四川农业大学动物科技学院，成都 611130； 2．重庆市开州区农业发展服务中心，重庆 405499)
四川盆地由中国西部横断山脉、云贵高原、大巴山、武夷山环绕形成，盆地北部大巴山横直在万源宣汉北部，明月山、铜锣山、华釜山由北而南纵卧其间，自然分割形成盆地和丘陵地貌。海拔跨度极大的地势造就了丰富的生物多样性，形成了包括国家畜禽遗传资源旧院黑鸡、城口山地鸡、大宁河鸡等在内的家禽品种[1]。在大巴山脉与长江山峡的交界处，有1个新的家禽品种岩水鸡，其体态轻盈，羽色为纯黑或纯白，目前处于地方畜牧部门保护开发的计划中。南部地区武夷山和云贵高原的交汇点也有显着的海拔变化，分布着沐川乌骨鸡、丰岩乌骨鸡等家禽品种[2]。
城口山地鸡地处重庆市城口县，为肉蛋兼用型品种，羽色纯黑，黑肤、乌肉，肉质细嫩，深受当地人民的喜爱。旧院黑鸡主产于四川省万源市旧院镇，是肉蛋兼用型品种，外观与城口山地鸡近似，羽色纯黑，黑肤、乌肉，肉质鲜美[3]。大宁河鸡产于重庆市巫溪县，属兼用型地方品种，公鸡红羽，母鸡黄麻羽。岩水鸡白羽和黑羽群体产于重庆开州区，北邻城口东邻巫溪，是出名的高寒山区，该品种环境适应性强，肉蛋兼用[4]。丰岩乌骨鸡羽毛、皮、骨、肉俱黑，产于四川泸州叙永县，已有300年以上历史，长期以来当地苗、汉农民就养殖乌骨鸡馈赠亲友，配以中草药滋补疗疾。
近年来随着经济的发展，交通的便利，出现了相邻地域品种混杂，毛色不纯，肤色变浅等问题，根据农业部的报告，一些地方鸡种的种群数量一直在迅速减少甚至濒临灭绝[5]。第三次全国畜禽遗传资源普查品种鉴定工作正在开展，为说明四川及其临近区域品种间遗传多样性，便于后续的品种保护和开发利用[6]，本研究采用简化基因组开展了6个地方鸡群体的遗传研究。简化基因组测序技术(genotyping-by-sequencing，GBS)是在二代测序基础上发展起来的[7]，通过酶切加标签的方法测序获得酶切位点附近基因序列信息，进而检测大量高准确性的SNP变异位点信息，可了解种质资源的遗传背景和系统演化，研究群体亲缘关系及种群结构[8]。Pértille等[9]用GBS法对462只鸡进行测序，鉴定出67 096个SNPs，全基因组覆盖率为4.66%。猪群测序检测到假定的SNPs，平均密度为每10 kb有0.33个SNPs[10]。此外，在一项牛研究中还鉴定出63 797个SNPs[11]。GBS是一种经济高效的方法，已成功地应用于群体遗传学研究[12-14]。
1 材料与方法
1.1 试验材料
本研究使用了来自5个保种场的6个地方品种鸡，每个品种选取20个个体(10公、10母)共120只，150～250日龄，分别为城口山地鸡、大宁河鸡、旧院黑鸡、丰岩乌骨鸡、岩水鸡黑羽和岩水鸡白羽，采样信息见表1。将样本进行翅下静脉采血，并保存于-20 ℃。使用标准的苯酚/氯仿方法从全血中提取基因组DNA。用分光光度计(德国埃普多夫公司)定量DNA浓度，并将样品稀释至最终浓度100 ng·μL-1[15]。
表1 地方鸡群体采样信息
1.2 试验方法
1.2.1 简化基因组测序和SNP 鉴定 DNA样品送往广州基迪奥生物科技有限公司利用Gallusgallus基因组(GenBank登录号：GCF_000002315.6)作为参考基因组，用GBS技术构建测序文库，采用限制性内切酶CTGCAG(PstⅠ) + CATG(NlaⅢ)对DNA进行酶切，连接回收后对片段使用高保真酶进行PCR扩增，测定PCR产物浓度后将混好的文库上机测序(Illumina HiSeqTM 2500)。
高通量测序得到的原始图像数据文件经碱基识别转化为原始测序序列，过滤后使用比对软件BWA(0.7.12)采用mem算法后将过滤后的reads比对到参考基因组上，比对参数为-k 32 -M；比对完之后结果使用PICARD(版本1.129)软件进行标记[16]。使用变异检测软件GATK(版本3.4-46)进行群体SNP检测，然后使用ANNOVAR(版本2)对检测出的突变位点进行功能注释。
1.2.2 遗传数据分析 用Perl编程计算观测杂合度(observed heterozygosity，Ho)、期望杂合度(expected heterozygosity，He)、多态信息含量(polymorphic information content，PIC)、观测等位基因数(number of observed alleles，Na)、有效等位基因数(number of effective alleles，Ne)、核苷酸多样性(nucleotide diversity，Pi)、遗传分化系数(F-statistic，Fst)、遗传距离(genetic distance，DR)及基因流(gene flow，Nm)。利用软件GCTA(Version 1.25.0)进行主成分分析(principle component analysis，PCA)，采用邻接法(neighbor-joining method)构建系统发生树，通过Treebest软件计算距离矩阵，系统发生树的可靠性通过Boot-strap法进行检验。使用Admixture软件(v1.3)[17]进行群体结构的推断，分别假设样品的分群数(K值)为1～9， 然后进行聚类，根据交叉验证错误率来确定最优分群数。
2 结 果
2.1 6个地方鸡群体的基因组SNPs鉴定
2.1.1 测序质量 120个地方鸡样本，剔除2个核酸质量低的样本，通过GBS测序，剩余118个样本测序质量较高(Q20≥97.58%、所有样品的平均测序深度为20×，平均覆盖度为6.48%)。经过筛选过滤后，118个样品共获得291 359个高质量的SNPs位点。Q30≥92.74%，GC分布正常，群体样本与参考基因组的平均比对率为99.33%。
2.1.2 突变筛选 去除等位基因数大于2、缺失数据大于50%、次要等位基因频率小于5%、杂合度大于80%的标记(SNPs/Indels)，保留271 672个SNPs和19 687个Indels，用于群体遗传分析。
2.2 6个地方鸡群体的遗传多样性分析
6个群体的核酸多态性范围为6.71×10-5(岩水鸡黑羽)～8.58×10-5(大宁河鸡)；观测杂合度范围为0.133(岩水白羽鸡)～0.168(城口山地鸡)；期望杂合度范围为0.154(岩水黑羽鸡) ～0.197(大宁河鸡)；多态信息含量范围为0.125(岩水黑羽鸡)～0.162(大宁河鸡)，属低度多态性(PIC<0.25)；观测等位基因数范围为1.534(岩水鸡黑羽)～1.750(城口山地鸡)；有效等位基因数范围为1.256(岩水鸡黑羽)～1.318(大宁河鸡)(表2)。整体上大宁河鸡和城口山地鸡的遗传多样性较高，岩水鸡黑羽和岩水鸡白羽的遗传多样性较低。
表2 6个鸡群体遗传多样性参数
2.3 6个地方鸡群体的遗传分化系数和遗传距离
6个群体间两两遗传分化系数(Fst)范围为0.053～0.183，遗传距离(DR)为0.087～0.119，基因流(Nm)为1.12～4.50。岩水鸡黑羽与大宁河鸡、旧院黑鸡、丰岩乌骨鸡，岩水鸡白羽与丰岩乌骨鸡的遗传分化较大(0.15≤Fst≤0.25)，其余品种之间的遗传分化中等(0.05≤Fst≤0.15)。群体间遗传分化最大的是丰岩乌骨鸡和岩水鸡黑羽群体(Fst=0.183)，最小的是城口山地鸡和大宁河鸡(Fst=0.053)。群体间遗传距离最近的是岩水鸡黑羽和白羽群体(DR=0.087)，遗传距离最远的是大宁河鸡和岩水鸡白羽群体(DR=0.119)。群体间基因流动最大的是大宁河鸡和城口山地鸡(Nm=4.05)，流动最小的是岩水鸡黑羽和丰岩乌骨鸡(Nm=1.12)(表3和表4)。
表3 6个群体间的遗传分化系数(Fst)和遗传距离(DR)
表4 6个群体的基因流
2.4 6个地方鸡群体遗传结构分析
2.4.1 主成分分析 对获得的SNPs标记进行主成分分析，结果表明3个主成分变异贡献率分别为7.31%、4.31%和4.04%(图1)。由图1可以看出，城口山地鸡、大宁河鸡、旧院黑鸡形成一个紧密的类群，丰岩乌骨鸡、岩水鸡白羽和黑羽相对独立，并且丰岩乌骨鸡和岩水鸡黑羽群体相对集中，岩水鸡白羽群体相对分散。
2.4.2 系统发生树分析 根据地方鸡6个群体的系统发生树可以明显看出(图2)，城口山地鸡、大宁河鸡、旧院黑鸡和丰岩乌骨鸡各自聚为一类，岩水鸡白羽和黑羽聚为一类。
图1 地方鸡6个群体的主成分分析Fig.1 Principal components analysis of 6 local chicken populations
图2 地方鸡6个群体的系统发生树Fig.2 Phylogenetic tree of 6 local chicken populations
2.5 6个地方鸡群体遗传结构分析
预设群体分群数从2到9，通过Admixture软件分析地方鸡的群体结构，根据交叉验证错误率的谷值确定最优分群数(K)。如图3所示，当K=5时交叉验证错误率最低，说明本研究分析的样品最大概率来自于5个原始的祖先。图4展示了6个群体的遗传结构。当K=2和3时，岩水鸡黑羽和白羽明显具有和其它品种不同的来源。在K=4时，丰岩乌骨鸡与岩水鸡黑羽遗传结构差异大，而城口山地鸡、大宁河鸡、旧院黑鸡遗传结构近似。在K=5时，大宁河鸡、旧院黑鸡、丰岩乌骨鸡和岩水鸡黑羽遗传差异明显，城口山地鸡和岩水鸡白羽呈现出部分血液混杂，K=6～9呈现出更详细的品种遗传信息。
图3 交叉验证错误率Fig.3 Cross validation error rate
3 讨 论
对品种内多样性和物种种群结构的了解是改进品种选择计划、了解群体环境适应性和政府实施种群保护计划的基础[18-19]。虽然大多数群体遗传结构研究都针对世界性的商用品种，但人们对地方品种的遗传学关系越来越感兴趣，因为它们可以从根本上理清品种的内在关系[20]。
本试验利用简化基因组研究了四川盆地周边山脉6个地方鸡种的基因组多态性。期望杂合度(He)和多态信息含量(PIC)是衡量标记多态性较好的指标[21-22]。6个地方鸡品种的He范围为0.154～0.197，平均期望杂合度和Cendron等[23]用全基因组测序分析意大利地方品种鸡的结果相似。6个地方鸡品种的PIC范围为0.125～ 0.162，为低度多态性(PIC<0.25低度多态性；0.25
图4 6个地方鸡品种的结构聚类分析Fig.4 Structure clustering of 6 local chicken populations
为了解这6个地方品种之间的遗传关系和群体结构，本研究计算了群体的遗传分化指数(Fst)和遗传距离(DR)的成对估计，并进行了主成分、系统发生树和Structure分析。Fst揭示了种群间的遗传分化程度，本试验中城口山地鸡和大宁河鸡间分化中等，旧院黑鸡和丰岩乌骨鸡间分化较大[29-30]。前人的研究表明，印度[31]、中国[32]和非洲本土鸡群[33]的Fst值较高(0.15到0.26)，而Rashid等[34]报告了孟加拉国5个地方鸡种的Fst在0.084～0.154之间。Hassen等[35]报告了埃塞俄比亚西北部7个土生鸡种群的地理距离从0.073到0.13。Seo等[36]发现5个韩国本土鸡之间的成对遗传距离为0.083～0.171。本研究结果与上述3个研究结果相似，遗传距离值较小。此外，Yamamoto[37]的研究报告了孟加拉土鸡不同群体之间的遗传分化程度较低。总体而言，四川盆地地方鸡群体间的遗传分化程度较低，这可能是由于它们之间以及构建群体的共同祖先之间的基因流动所致。本研究中Fst和基因流都显示城口山地鸡和大宁河鸡群体间的分化程度最小，丰岩乌骨鸡和岩水鸡黑羽群体间的分化最大。系统发生树显示，岩水鸡白羽和岩水鸡黑羽聚为一类，与基因流结果一致。利用Structure程序对中国地方6个鸡群的遗传结构进行了研究，当K=5时，交叉验证错误率最低，说明本研究分析的样品应该是来自于5个原始的祖先。结构数据还表明，在每个群体中有一定比例的遗传混合来自其他品种，邻近地区或种群可能存在一定的基因流动。同时结构数据表明，丰岩乌骨鸡和旧院黑鸡被明显分离开，这与主成分分析和系统发生树的结果一致。前人研究认为，两个品种间的遗传相似系数为0.795，二者亲缘关系较近[38]。检测方法不同可能导致了结果差异[39]。本研究结果还表明，岩水鸡白羽处于系统发生树的最远分支，与本研究其他地方鸡种相比存在明显的遗传差异。这在主成分、Fst和基于模型的聚类结果中均有体现。这个聚类结果与各品种在四川盆地的分布区域基本吻合, 说明四川地方鸡品种的形成与地理环境存在很大的关系[40]。
4 结 论
本研究应用简化基因组对四川盆地的6个地方鸡品种进行分析，结果发现岩水鸡黑羽群体的遗传多样性较低，大宁河鸡遗传多样性最为丰富。城口山地鸡和大宁河鸡之间的遗传分化最低，基因流最高，丰岩乌骨鸡和岩水鸡黑羽群体之间的遗传分化最高，对应的基因流最低。岩水鸡白羽群体和黑羽群体聚为一类，城口山地鸡、大宁河鸡和旧院黑鸡聚为一类，丰岩乌骨鸡单独为一类。位于乌蒙山区的丰岩乌骨鸡与大巴山脉的旧院黑鸡、城口山地鸡、大宁河鸡、岩水鸡黑羽和白羽具有较远的遗传距离。
