CHO细胞表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白及免疫原性分析

李亚军，茹 毅，郝荣增，蒋成辉，王 伟，张 越，张贵才，刘华南，卢炳州，杨 洋，陶世宇，杨 锐，宋向东，陈 娇，余四九，郑海学*

(1.甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070； 2.中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室/国家口蹄疫参考实验室，兰州 730046)

牛病毒性腹泻(bovine viral diarrhea, BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)引起的以腹泻、繁殖障碍、免疫机能障碍等为主要特征的一种急性、热性、高度接触性传染病[1]，该病发病率高，死亡率低[2]，防治的难点在于BVDV进入机体后可造成免疫抑制和持续性感染，降低机体免疫力，易诱发其他病原的混合感染或继发感染，是全球最重要的牛传染病之一[3]。该病在我国20多个省、市及自治区广泛流行且呈扩大趋势[4]，导致我国的BVDV防控和净化状况不容乐观。

BVDV属于黄病毒科(Flaviviridea)瘟病毒属(Pestivirus)，基因组由一个长度约12.3 kb的单链正义RNA分子组成[5]。BVDV有3种生物型，通常基于5′-UTR序列、基因组氨基端自身蛋白酶(Npro)或包膜糖蛋白(E2)区域分为BVDV-1型和BVDV-2型[6]，第3种遗传物种BVDV-3型被描述为非典型的BVDV。目前，中国主要流行8个亚型：1a、1b、1c、1d、1m、1o、1p和1q[7]。BVDV基因组含有4个结构蛋白，分别是P14(C)、gP48(E0)、gP25(E1)、gP53(E2)，其他的均为非结构蛋白[5,8]。其中，E0、E1、E2组成了病毒的囊膜结构，位于病毒的表面，而E2蛋白位于病毒的外表面，也是构成病毒的主要免疫保护性抗原，可诱导机体产生保护性的中和抗体[9]。动物机体在感染BVDV或者接种灭活疫苗后，体内主要产生针对结构蛋白E2的抗体[10]，对于病原的检测应用，由E2蛋白产生的多克隆抗体可以快速检测BVDV的变异[11]。E2蛋白包括1个疏水序列和5个糖基化位点[12]，但由于E2蛋白的基因突变率高，不同的毒株之间的免疫原性不同，容易导致疫苗免疫失败[13]。

有报道显示，E2蛋白在细胞周期的维持中扮演着重要角色，它主要参与病毒和宿主的吸附、识别以及结合过程，还参与病毒的免疫逃逸[14]。吴桐忠等[15]构建了表达E2蛋白的重组乳酸菌，结果表明，口服表达BVDV E2蛋白的重组乳酸菌可诱导机体产生特异性的体液免疫反应；何金科等[16]完成了E2蛋白多表位疫苗的筛选以及生物信息学验证等，为多表位疫苗的设计提供了一种新的方法；张忠辉等[17]利用原核表达系统表达制备E2蛋白，并免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体；吴立君等[18]利用昆虫表达系统表达E2蛋白，为诊断试剂盒的研制和亚单位疫苗的制备奠定了基础。以上研究表明，BVDV E2蛋白已成为BVD基因工程疫苗和诊断试剂开发研制的重要靶标蛋白，而利用不同表达系统制备的E2蛋白免疫动物后，可诱导机体产生不同程度的细胞免疫或体液免疫应答，因此，E2蛋白成为BVDV DNA疫苗和亚单位疫苗开发的首选抗原蛋白[19]。

目前，控制BVDV的传播主要有两种方法：消灭持续感染动物和疫苗接种。改良活疫苗或灭活疫苗主要用于BVDV疫苗接种计划，但这些疫苗分别存在安全风险或免疫保护不足等问题[20]。灭活疫苗对怀孕牛安全，但其免疫期短；而弱毒疫苗虽免疫期长，但对怀孕牛存在安全风险[21]。基于以上科学问题，本研究以研制BVD亚单位疫苗为目标，成功利用哺乳动物细胞表达系统制备了BVDV结构蛋白E2，实现了该蛋白在哺乳动物表达系统CHO细胞中高水平瞬时表达，通过免疫动物评价其免疫原性，为BVDV的基因工程亚单位疫苗的研发奠定良好的基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

1.1.1 实验动物 新西兰大白兔由中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂和仪器 BVDV-1 NADL疫苗标准株(BVDV-1型毒株，购自中国兽医药品监察所-中国兽医微生物菌种保藏管理中心)、真核表达载体pcDNA3.1(+)、BVDV阳性血清由本实验室保存。ExpiCHO悬浮细胞表达系统、亲和层析Ni柱购自GE公司。XhoⅠ和HindⅢ限制性内切酶购自New England Biolabs(NEB)公司。

主要仪器：PCR扩增仪(Thermo)、台式超速冷冻离心机(Thermo)、紫外凝胶成像仪(GE)、纯化仪(AKTA PURE 150)、激光共聚焦显微镜(莱卡公司)。

1.2 蛋白生物信息学分析和表达设计

利用SignalP 4.1 Server和TMHMM Server v.2.0网站软件分析BVDV结构蛋白E2信号肽及跨膜区域。根据分析结果，设计E2蛋白的重组真核表达质粒。

1.3 重组表达质粒的构建与鉴定

参考BVDV-1 NADL疫苗标准株基因序列，设计扩增目的基因引物(如表1所示)，利用病毒RNA提取试剂盒常规提取RNA，以提取的RNA为模板，利用一步法RT-PCR扩增试剂盒扩增E2蛋白的基因片段，扩增程序:50 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ (1 min·kb-1)，30个循环；72 ℃ 5 min。PCR扩增产物利用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，纯化回收DNA。pcDNA3.1载体和回收的基因片段用限制性内切酶XhoⅠ和HindⅢ双酶切，切胶回收纯化，使用T4 DNA连接酶连接，程序为16 ℃ 12 h，连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取单菌落增菌培养，利用质粒提取试剂盒提取重组质粒，重组质粒命名为pcDNA3.1-BVDV-E2。

用XhoⅠ和HindⅢ对重组质粒进行双酶切鉴定，鉴定正确的重组质粒均送生物公司进行测序鉴定，确定目的基因序列的正确插入，确保阅读框完全正确。

表1 引物信息

1.4 蛋白的表达与纯化

参照ExpiCHO表达系统试剂盒说明书方法，将重组质粒pcDNA3.1-BVDV-E2转染ExpiCHO悬浮细胞，转染的细胞置32 ℃、5% CO2、湿度90%条件下继续悬浮培养12 d，然后4 000g离心10 min，经0.22 μm滤膜过滤后进行亲和层析Ni柱纯化。取纯化后的目标蛋白质进行SDS-PAGE鉴定，并使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度。

1.5 蛋白印迹试验

将纯化后的蛋白经质量分数为12% SDS-PAGE电泳分离，通过半干式电转膜法将蛋白抗原转至硝酸纤维素薄膜上，分别使用抗小鼠His Tag单克隆抗体、BVDV阳性血清或BVDV-E2免疫血清为一抗，HRP标记的山羊抗小鼠和山羊抗兔IgG为二抗，对纯化的BVDV-E2蛋白或BVDV感染细胞内的病毒蛋白进行Western blot分析，用ECL化学发光显色后，高分辨率凝胶成像系统观察并拍照。

1.6 免疫荧光(IFA)试验

按照试验要求设置对照组和试验组；在激光共聚焦细胞培养皿中培养MDBK细胞，接种病毒感染后48 h将细胞用PBS进行洗涤；用4%多聚甲醛室温固定10 min，PBS洗涤3次，每次5 min，分别加入1 mL用一抗稀释液按1∶100稀释的免疫血清，4 ℃，孵育12 h；1×PBS洗涤3次，每次5 min，分别加入500 μL用1×PBS按1∶1 000稀释的488标记的山羊抗兔IgG，37 ℃孵育1 h；1×PBS洗涤3次，每次5 min，用激光共聚焦荧光显微镜观察细胞内荧光并拍照分析。

1.7 动物免疫与抗体检测

选取健康新西兰大白兔6只，分为2组，每组3只，A组免疫纯化的E2蛋白，B组为PBS对照组，首次免疫用300 μg·只-1的纯化蛋白和等体积的弗式完全佐剂乳化，背部多点注射免疫兔；首次免疫第14天，按照300 μg·只-1的纯化蛋白和等体积的弗式不完全佐剂乳化，背部多点注射进行二免，分别采集首免后第0、7、14、21、28天取全血，分离血清用于抗体检测。

采用间接ELISA对E2蛋白免疫兔血清进行检测，分析其免疫原性。用50 mmol·L-1碳酸盐缓冲液将纯化的BVDV-E2蛋白(50 ng·孔-1)包被于ELISA酶标板中，4 ℃孵育过夜。用1%牛血清白蛋白(BSA)37 ℃，封闭2 h。将待检血清用血清稀释液按1∶2 000稀释并加入反应孔中，100 μL·孔-1，每个样品设3个复孔，37 ℃孵育1 h。HRP标记的山羊抗兔IgG抗体用血清稀释液按1∶5 000稀释后加入反应孔中，100 μL·孔-1，37 ℃孵育1 h。TMB显色，每孔50 μL，显色10 min后，加入50 μL终止液终止反应，读取OD450 nm值。

2 结 果

2.1 E2蛋白分析与表达设计

软件分析结果显示，SignalP 4.1 Serve软件分析显示E2蛋白不存在信号肽(图1A)；TMHMM Server v.2.0软件分析显示E2蛋白有一个跨膜区(第344—366位氨基酸)(图1B)。本研究根据分析结果，删除E2蛋白跨膜区，在目标蛋白氨基端插入信号肽序列、羧基端为His-Tag，依次串联组成蛋白表达阅读框(图1C)。

2.2 E2重组表达质粒的鉴定

RT-PCR扩增结果经核酸凝胶电泳鉴定显示，基因扩增片段大小约为1 330 bp，与预期的目的条带大小相符(图2A)。构建的重组表达质粒pcDNA3.1-BVDV-E2经XhoⅠ和HindⅢ双酶切后产生大小约5 109和1 358 bp的2条特异性条带，酶切产物大小与理论值相符，表明扩增的E2片段正确与载体连接，而基因测序结果也显示目的片段成功插入表达载体中(图2B)。

2.3 E2蛋白的表达与纯化

转染pcDNA3.1-BVDV-E2质粒的细胞培养上清在56 ku左右(图中箭头所示)位置处观察到特异性蛋白条带，蛋白大小与理论值相符(图3A)。对BVDV-E2蛋白进行纯化，洗脱样品在56 ku左右位置处观察到特异性蛋白条带，BCA蛋白定量试剂盒测定纯化后E2蛋白的质量浓度为1.228 mg·mL-1(图3B)。

2.4 重组蛋白的鉴定

纯化后BVDV-E2蛋白能够与His-Tag标签抗体(图4A)和BVDV阳性血清(图4B)发生反应，都约在56 ku位置处显示一条特异性条带。

将BVDV感染MDBK细胞24 h，利用BVDV-E2免疫兔血清检测细胞内的病毒蛋白表达，结果显示约在56 ku位置处显示一条特异性蛋白条带(图4C)，表明该E2蛋白免疫血清可以特异性地与BVDV感染细胞内的E2蛋白反应。

A.E2蛋白信号肽分析结果；B.E2蛋白跨膜区分析结果；C.BVDV-E2蛋白表达质粒示意图A. Result of E2 protein signal peptide sequence analysis; B. Result of E2 protein transmembrane region analysis; C. Diagram of expression plasmid of BVDV-E2 protein图1 BVDV-E2蛋白分析与表达设计Fig.1 Analysis and expression design of BVDV-E2

2.5 细胞免疫荧光(IFA)试验

IFA鉴定结果显示(图5)，BVDV感染MDBK细胞后，免疫血清可以特异性检测到细胞内的病毒蛋白表达，而对照组未检测到荧光；结果表明，本研究制备的E2蛋白免疫血清具有良好的免疫反应性和特异性。

2.6 血清抗体水平

间接ELISA结果显示(图6)，免疫后7 d，即可检测到针对E2蛋白的血清抗体，二免7 d后抗体水平显着升高，在免疫后28 d抗体保持较高水平且血清效价可达1∶1 024 000。结果证明了CHO细胞表达的E2蛋白具有良好的免疫原性。

3 讨 论

近年来，关于BVD基因工程疫苗研究在不断地进行，但仍无商品的亚单位疫苗可用[22]。E2蛋白作为BVDV囊膜上的重要结构蛋白，拥有突出囊膜表面的氨基端部分，决定了BVDV的抗原性[23]，其免疫原性最好，是亚单位疫苗研究的主要抗原蛋白[24-25]。

A.RT-PCR扩增基因片段鉴定(M. DL2000 DNA相对分子质量标准；1.E2基因片段)；B.重组表达质粒双酶切鉴定(M. DL10000 DNA相对分子质量标准；1.未酶切E2表达质粒；2.E2表达质粒的酶切产物)A. Identification of gene fragments amplified by RT-PCR(M. DL2000 DNA marker; 1. E2 gene fragment); B. Identification of recombinant expression plasmid by double enzyme digestion (M. DL10000 DNA marker; 1. Undigested E2 expression product; 2.Digested E2 expression product)图2 重组表达质粒的鉴定Fig.2 Identification of recombinant expression plasmid

A.E2蛋白表达的SDS-PAGE分析(M.蛋白质分子质量标准；1.空白对照；2.空载体对照；3.转染pcDNA3.1-BVDV-E2)；B.纯化后E2蛋白SDS-PAGE分析(M.蛋白质分子质量标准；1.过滤后细胞上清；2.流穿样品；3.洗脱样)A. SDS-PAGE analysis of the expression of E2 protein (M. Protein marker; 1. Blank control; 2. Empty plasmid control; 3. Transfected pcDNA3.1-BVDV-E2); B. SDS-PAGE analysis of E2 protein after purification (M. Protein marker; 1. Cell supernatant after filtration; 2. Flow through sample; 3. Elution sample)图3 重组蛋白的表达与纯化Fig.3 Expression and purification of recombinant protein

A.一抗为His-Tag单克隆抗体(M.预染的蛋白质分子质量标准；1.BVDV-E2)；B.一抗为BVDV多克隆抗体(M.预染的蛋白质分子质量标准；1.BVDV-E2)；C.E2蛋白免疫血清检测BVDV感染MDBK细胞的免疫印迹分析(M.预染的蛋白质分子质量标准；1.未感染细胞对照；2.BVDV感染MDBK细胞)A. Western blot identification with His Tag monoclonal antibody (M. Protein marker; 1. BVDV-E2); B. Western blot identification with BVDV polyclonal antibody (M. Protein marker; 1. BVDV-E2); C. Analysis of E2 protein expression in MDBK cells after BVDV infection by Western blot (M. Protein marker; 1. Uninfected cell control; 2. BVDV infected MDBK cells )图4 纯化后E2蛋白的免疫印迹分析Fig.4 Analysis of E2 protein after purification by Western blot

图5 IFA鉴定结果Fig.5 Identification of immunized serum by IFA

NC. PBS免疫组；E2. BVDV-E2蛋白免疫组NC. The group of immunized by PBS; E2. The group of immunized by purified E2 protein图6 间接ELISA分析血清抗体Fig.6 Analysis of serum antibodies by indirect ELISA

目前，在国内关于BVDV E2蛋白表达的相关研究中，大多数采用原核表达系统进行表达[10,17,26]，也有报道利用烟草等真核表达系统表达E2蛋白[18,27]。BVDV E2蛋白为囊膜糖蛋白，含有多个糖基化位点，其翻译后修饰较为复杂，利用原核表达系统表达此类抗原蛋白存在一定的难度，且原核表达的产物抗原性一般较弱，并且大多数情况表达产物以不可溶形式存在，蛋白结构和翻译后修饰与真核表达存在较大差异[28]。通过真核表达系统表达的目的蛋白具有天然蛋白的构象和活性，与昆虫细胞杆状病毒表达系统相比，CHO细胞表达系统表达产量相对比较高，很少分泌自身内源性蛋白，利于外源产物的分离纯化；与细菌表达系统相比，CHO细胞表达系统可对蛋白进行翻译后加工，可胞外分泌表达，下游纯化工艺简单；与酵母表达系统相比，CHO细胞表达系统产物的免疫原性等生物活性与天然蛋白更相似，能够有效减少非特异性结合[29]。随着无血清悬浮培养技术、基因工程技术和大规模培养技术的应用和不断发展，CHO细胞表达系统产物表达量得到大幅提升，生产成本不断降低，在兽用产品领域的应用也显现出良好前景[30]。本研究为了获得免疫原性良好的BVDV抗原蛋白，使用CHO悬浮细胞对目标抗原进行分泌表达，并通过亲和层析法进行纯化，通过一步亲和纯化即可获得较高纯度的抗原蛋白，并且蛋白表达量显着高于其他报道水平；为CHO细胞表达系统在兽用生物制品领域的应用提供了新的范例。

4 结 论

本研究首次成功利用CHO细胞表达细胞制备了BVDV E2蛋白，鉴定结果显示，E2蛋白与BVDV阳性血清和His标签抗体有良好的反应性，同时免疫结果显示，制备的E2蛋白可诱导免疫动物产生强烈的体液免疫反应，免疫后第28天抗体水平仍保持较高水平；此外，利用动物免疫血清可特异性检测感染细胞内的病毒蛋白表达。本研究结果为BVD新型亚单位疫苗研制奠定了基础。