金寰，潘贵书
(遵义医学院生理学教研室，贵州遵义563000)
药物滥用是一个世界性的难题，药物滥用问题目前在我国还处于上升阶段，海洛因是半合成阿片受体纯激动剂，是国内外最常见的滥用成瘾药品，易透过血脑屏障进入中枢神经系统，其毒性和成瘾性较大。成瘾药物对全身各个系统都有不同程度的损害，其中以神经系统损害最为严重。研究显示阿片类药物成瘾者存在记忆功能的障碍，脑内学习记忆的重要器官海马参与了药物成瘾的形成。本实验通过建立海洛因成瘾大鼠模型，观察韩氏穴位神经刺激器（Han's Acupoint and Nerve Stimulator，HANS）对海洛因成瘾大鼠海马细胞凋亡的影响，初步探讨海洛因对大脑的损害以及HANS针刺在治疗海洛因成瘾过程中的作用机制，为海洛因成瘾的防治提供新的理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 健康Wistar大鼠（重庆第三军医大学动物实验中心提供，生产许可证号：SCXK（军）2002008）40 只，雄性，体重 220±20g，适应喂养 1w后开始造模。
1.1.2 主要试剂 海洛因(贵州省公安厅提供)，盐酸纳洛酮注射液(湖南益侨制药有限公司，批号20060904)，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 海洛因成瘾大鼠模型的建立[1]将大鼠随机分成正常组，成瘾组，戒断组和针刺组，每组10只。每组大鼠逐日递增连续皮下注射海洛因9d，首日剂量每次3mg/kg，一日两次（第9天剂量达到27mg/kg）；正常组按同样的方式注射等量生理盐水。第10天正常组和打海洛因组大鼠各取5只用腹腔注射纳洛酮5mg/kg诱发戒断症状，戒断症状包括可数症状：齿颤、扭体、站立、湿狗样抖、伸展、清理皮毛；不可数症状有上睑下垂，每2分钟评价一次，以上症状观察30min，记录它们的次数，根据文献进行戒断评分，与已建立的海洛因成瘾大鼠模型戒断标准比较，确定建模成功，后正常组用生理盐水维持，其余三组继续用海洛因维持（27 mg/kg），每天1次，连续2d；2d后正常组与成瘾组处死，戒断组与针刺组停止给药，针刺1组进行HANS针刺。
1.2.2 HANS针刺[2]参照大鼠常用针灸穴位使用LH-402型韩式穴位神经刺激仪行针刺，将其经皮电针刺激改为不锈钢针灸针皮下刺入。用乙醚浅麻醉后将大鼠放在特制的鼠笼里，并在清醒时给予针刺，选取大鼠双侧的“足三里”穴（腓骨小头下约5mm，在胫腓骨间隙中，皮下有腓骨肌、腓神经及胫前后动静脉分布）和"三阴交"穴（后肢内踝尖上10mm，皮下有趾深屈肌、胫神经及胫后动静脉分布），找准穴位局部酒精消毒，进针捻转进入，留针，不进行手法刺激。针刺方法：连接，波宽：0.2/0.6ms；频率：2/100Hz；以大鼠下肢轻微抖动为度，强度按1～2～3mA递增，每一强度连续刺激10min，共30 min。每日1次，均在上午9:00治疗，连续5d。
1.2.3 Annexin V-FITC/PI法检测海马细胞凋亡[2]正常细胞膜磷脂的分布是不对称的，膜内表面含有带负电的磷脂（如磷脂酰丝氨酸，PS），在细胞凋亡早期，细胞表面发生变化，细胞膜内部的磷脂酰丝氨酸（PS）迁移到细胞外层表面，Annexin V是一种对Ca2+依赖，对PS有高度亲和力的磷脂结合蛋白，可作为探针识别细胞膜表面是否有PS，从而识别凋亡细胞。凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料（如PI，Propidium Iodide）有拒染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞DNA可被PI着染而产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号，正常活细胞与此相似。所以用Annexin V-FITC/PI法来检测早期凋亡细胞。具体方法为将大鼠冰盘上断头处死，快速取出海马组织制备单细胞悬液：（1）组织于培养皿中剪碎成糜状；（2）加0.01 mol/LPBS离心，500转5 min，弃上清；（3）0.25%胰酶，37℃，30min；（4）500转 3min，弃上清；（5）0.01 mol/LPBS，300目滤网过滤静置后取上清液；（6）500 转 3 min，弃上清；（7）按说明书依次加试剂：500lBinding Buffer、5lAnnexin VFITC、5lPI；（8）室温，避光反应 15min。同时以不加Annexin V-FITC及PI的一管作为对照。
1.2.4 统计方法 采用SPSS 13.0 for Windows软件对实验结果进行统计分析，实验所得数据用平均数±标准差()表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way analysis of variance，one-way ANOVA），若方差齐则进行最小显着性差异检验（LSD），若方差不齐则采用Games-Howell检验。检验水准＝0.05<0.05，认为有统计学差异。
2 结果
Annexin V-FITC/PI法检测海马细胞凋亡双参数散点图见图1，其中左下象限显示活细胞；右上象限是非活细胞，即坏死细胞；而右下象限为凋亡细胞。各组大鼠海马部位凋亡的细胞占总细胞的百分比情况见表1，其中海洛因成瘾组与戒断组无统计学差异(>0.05)；针刺组与正常组无统计学差异(>0.05)；成瘾组、戒断组的细胞凋亡率比正常组明显增多(<0.05)，提示海洛因成瘾后可能会诱导神经细胞凋亡；而针刺组大鼠的凋亡率比成瘾组及戒断组的少(<0.05)，提示HANS针刺可在一定程度上改善神经细胞凋亡的情况。
图1 流式测各组大鼠海马细胞凋亡情况Fig1 Apoptotic rates were detected by flow cytometry
表1 各组大鼠海马部位细胞凋亡率（±,n=1 0）Tab 1 Apoptotic percentage of rat hippocam pus in different group（ ±,n=10
3 讨论
研究发现给大鼠慢性注射海洛因可以上调脑组织中皮质和海马部位的相关凋亡蛋白如Fasl、Fas和Bad等引起细胞凋亡从而损害大鼠的空间学习记忆[3]，连续给妊娠大鼠皮下注射海洛因发现海洛因暴露可增加小鼠前额叶皮层、海马和伏核脑区细胞凋亡关键因子caspase-3的表达[4]。现研究认为神经元凋亡是引起胚胎时期接受海洛因处理的小鼠的记忆损害及神经行为异常的机制之一[5~6]。我们前面的研究发现海洛因成瘾可损害大鼠的空间学习记忆[1],本实验又发现海洛因成瘾大鼠海马组织神经细胞凋亡增多，提示海洛因可能通过诱导相关脑区细胞凋亡增多而发挥其神经毒性作用。
目前电针戒毒因其具有安全、有效、简便、副作用少、痛苦小等特点而被用于临床戒毒治疗。随着分子神经生物学的进展，针刺作用的机制已成为众多学者关注的焦点，有研究发现[7]电针针刺血管性痴呆大鼠能通过阻断海马CA 1部位p53和Noxa的表达来减少海马细胞凋亡，从而保护海马锥形细胞，改善大鼠学习记忆能力。Feng S等[8]发现电针可以减轻因反复正加速度暴露引起的大鼠海马神经元凋亡。本实验中针刺组大鼠的凋亡率比海洛因成瘾组及戒断组的小，提示HANS针刺在一定程度上改善了海洛因成瘾大鼠神经细胞凋亡的情况。
海洛因成瘾致损害的机制复杂，细胞凋亡信号通道是一个复杂的网络系统，受多种细胞内外因素的调节，因此进一步研究其确切的机制，设法阻断与药物成瘾有关的细胞凋亡过程来预防或治疗药物成瘾可能是一个新的研究方向，为药物成瘾的防治提供新的思路。
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