鞘内注射AM1241对慢性坐骨神经结扎大鼠热痛阈的影响

曾俊伟,程年群,田虹,刘晓红

(遵义医学院生理学教研室暨贵州省麻醉与器官功能保护重点实验室,贵州遵义 563099)

·基础医学研究·

曾俊伟,程年群,田虹,刘晓红

(遵义医学院生理学教研室暨贵州省麻醉与器官功能保护重点实验室,贵州遵义 563099)

目的观察鞘内注射大麻素CB2受体激动剂AM1241对慢性坐骨神经结扎(CCI)大鼠热痛阈和Iba1表达的影响, 探讨CB2受体在大鼠神经病理性疼痛中的作用。方法成年SD大鼠24只，随机分：sham组(假手术组)、CCI组(坐骨神经结扎+鞘内注射生理盐水)、 AM 1241处理组(慢性坐骨神经结扎+鞘内注射AM 1241 10-3M)；连续14 d鞘内注射，在术后第1，3，5，7，10，14天测定给药0.5 h后热缩足潜伏期(TWL)。在第7，14天免疫组化观察背角Iba1表达变化。结果大鼠CCI术后1 d即可形成稳定的热痛敏；与sham组相比，CCI组第7，14天背角Iba1表达明显上调(P<0.05)；与CCI组相比，鞘内注射CB2受体激动剂AM1241(10-3M)明显延长CCI大鼠TWL(P<0.01)，但鞘内注射AM1241对CCI大鼠第7，14天背角Iba1表达上调没有明显影响。结论鞘内注射大麻素CB2受体激动剂AM1241可以发挥良好的镇痛效应，但AM1241不影响CCI大鼠脊髓背角Iba1表达的上调。

神经病理性疼痛；CB2受体；小胶质细胞

大麻素作为一种重要的神经活性物质，参与了机体的许多生理及病理过程的调节。目前认为，广泛分布于中枢和周围神经组织的大麻素CB1 受体(Cannabinoid receptor 1，CB1R)和CB2受体(Cannabinoid receptor 2，CB2R)参与了大麻类物质的镇痛效应。在动物足底注射角叉菜胶、弗氏佐剂导致的炎性疼痛模型或L5-L6脊神经结扎的神经痛模型，局部或全身应用CB2R激动剂HU308, AM1241、JWH-133都具有镇痛、抗炎症、抗伤害效应，这充分说明CB2R参与了大麻素类药物的镇痛作用[1-4]。近年研究表明，脊髓背角小胶质细胞在神经病理性疼痛的发生发展中起着重要的作用，而大麻素CB2 受体选择性表达于背角小胶质细胞[4-5]。因此，本研究鞘内注射大麻素CB2受体激动剂，观察其对慢性坐骨神经结扎(CCI)大鼠热痛阈及脊髓背角小胶质细胞Iba1表达变化的影响, 探讨大麻素CB2受体在神经病理性疼痛中的作用，并初步分析其作用机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组健康成年雄性SD大鼠24只，200～250 g，购自第三军医大学实验动物中心[许可证号SCXK(渝) 2007-0005]。大鼠随机分：假手术组、CCI组(坐骨神经结扎+鞘内注射生理盐水)、AM 1241处理组(慢性坐骨神经结扎+鞘内注射AM 124110-3M)；假手术组大鼠仅暴露坐骨神经不进行结扎。其余大鼠在鞘内置管5d后进行坐骨神经结扎，术后分别鞘内注射生理盐水，AM1241(10-3M，20 μL)。

1.2 主要药品和仪器 AM 1241购自Sigma, 使用前溶于5% DMSO盐溶液中；山羊Iba1抗体购自abcam；抗体稀释液、山羊免疫组化试剂盒及DAB试剂盒均来自北京中山金桥公司；多聚甲醛，成都科龙华工试剂厂；PE-10导管来自美国健康医疗仪器国际公司；TF2一光热测痛仪为中国医学科学院药物研究所研制。

1.3 鞘内置管及CCI模型制作大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠3 mL/kg，麻醉后取俯卧位, 在腰3～4间隙作长约3 cm 的皮肤纵切口，切开该处背棘肌的后筋膜, 切除腰4棘突和邻近椎板, 暴露腰4 与腰3棘突间隙，以25G针穿破黄韧带及硬脊膜，可见清亮的脑脊液溢出。经破口处插入PE-10导管2 cm，18G硬膜外穿刺针在大鼠皮下穿一隧道，将导管的另一端送至颈背部，外露2 cm固定，外口用打火机封闭，防止脑脊液外溢。术后第2天，经PE-10导管注入2%盐酸利多卡因(20 μL)，大鼠两后足瘫软, 30 min左右恢复，即鞘内置管成功。大鼠鞘内置管7 d后，腹腔注射1%戊巴比妥钠3 mL/kg，麻醉后俯卧位固定; 在股骨外侧上方纵向切开皮肤，顺肌纹钝性分离肌肉，暴露坐骨神经，用5.0铬制羊肠线轻度结扎左坐骨神经干，共结扎4道，结扎间距约为1 mm；结扎强度以引起小腿肌肉轻度颤动为宜。术后当天肌注青霉素避免感染。

1.4 行为学测定热辐射法测定大鼠热缩足潜伏期(thermal withdrawal latency, TWL )。按Harg reaves的方法[8]用利用利用TF2-光热测痛仪的小型聚光灯产生一定强度的光，通过聚焦产生热量，将光辐射焦点对准大鼠足跖底中部，从照射开始至大鼠出现抬腿回避时为TWL。自动切断时间为25 s，以防止组织损伤。连续测3次，间隔 5 min，取其平均值。为防止热辐射损伤，光照最长时限定为30 s。热刺激强度在整个实验过程中维持一致。每只动物给药后测定3次，每次间隔5 min，取其平均值为大鼠TWL值。

1.5 免疫组化在CCI术后7，14 d，大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉后迅速开胸暴露心脏，经升主动脉插管，先以400 mL 生理盐水冲净血液，随即灌注含4%多聚甲醛的0.01M PBS 500 mL固定。取腰段脊髓浸入4% 4°C多聚甲醛3 h,随后30%蔗糖多聚甲醛溶液中过夜。脊髓连续冰冻切片，片厚20 μm，置0.01 mol/L PBS中。0.01M PBS中漂洗切片，5 min×3次；3% H2O2封闭 10min，0.01M PBS中漂洗切片，5 min×3次；兔血清 37 ℃封闭20 min，加入山羊Iba1抗体(1∶400)，37 ℃ 2 h，4 ℃冰箱过夜；0.01M PBS中漂洗切片, 5 min×3次；加入山羊二抗，37 ℃ 1 h，0.01M PBS中漂洗切片, 5 min×3次；DAB显色，及时终止反应。梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。免疫组织化学染色标本在光镜(×200倍)下进行计算机图象分析(IPP6.0软件)，每组30张切片，根据阳性显色细胞轮廓来统计Iba1阳性细胞数目；并测量脊髓背角浅层区域Iba1阳性细胞光密度值。

2 结果

2.1 大鼠行为学改变假手术组鞘内注射生理盐水没有出现神经痛表现。大鼠CCI术后出现结扎侧患足足趾并拢背屈、舔舐、悬空等神经痛表现，但无运动功能障碍。鞘内注射AM1241的大鼠，大鼠结扎侧后足的足趾背屈、舔舐、悬空等自发神经痛行为有所减轻。

2.2 鞘内注射AM1241后TWL的变化在CCI术后第1～14天，注射生理盐水(20 μL)、AM1241(10-3M，20 μL)后0.5 h 测定TWL的变化。结果表明，与sham组相比，CCI术后1 d即出现TWL缩短(P<0.01)；与CCI组相比，注射AM1241后大鼠TWL延长(P<0.01)，特别是在第7天之后，AM1241处理组大鼠TWL延长更为明显(见图1与表1)。

注：与control相比,++P<0.01;与CCI组相比,**P<0.01。图1 鞘内注射AM1241后TWL的变化

表1鞘内注射AM1241后CCI大鼠TWL的变化(n=8)

组别control1d3d5d7d10d14dsham组2498±1332615±0202601±020263±025263±0762528±0772503±080CCI组246±151123±090a1347±055a1339±089a1389±152a1442±102a1435±087aAM1241组2408±1481324±135b1528±143b198±108b2079±098b2205±115b2212±149b

注：CCI组与sham组相比aP<0.05; AM1241组与CCI相比bP<0.05。

2.3 鞘内注射AM1241对CCI大鼠脊髓背角Iba1表达的影响在对照组脊髓背角，Iba1阳性细胞呈微量散在表达，细胞形态清晰，胞体较小, 具有多个伸向各个方向的细长突起。与对照组相比，CCI组大鼠在术后7 d和14 d，Iba1阳性细胞个数明显增加，细胞深染，胞体增大，突起增粗变长(见图2)，其平均光密度值明显增加(P<0.05)。与CCI组相比，在AM1241处理组, CCI术后7 d和14 d脊髓背角Iba1阳性细胞数目及平均光密度值虽然略有降低，但无统计学意义(P<0.05,见表2)。

注：A:CCI组7 d；B：CCI组14 d；C：AM1241+ CCI组7 d；D：AM1241+ CCI组14 d。图2 各组CCI大鼠大鼠Iba1表达变化

表2各组脊髓背角Iba1表达变化(n=8)

组别阳性细胞数目7d14d背角Iba1表达平均光密度7d14dSham组21．03±1．6222．21±0．640．03±0．010．05±0．01CCI组79．04±4．10a103．21±5．37a0．28±0．03a0．39±0．03aAM1241处理组76．36±2．08a98．02±5．37a0．24±0．04a0．36±0．02a

注：与sham组相比aP<0.05。

3 讨论

脊髓背角是机体对伤害性信息进行自身调制或整和的最重要位点之一。脊髓背角小胶质细胞激活是脊髓中枢痛敏发生和维持的关键因素。预先鞘内注射选择性的小胶质细胞活性抑制剂米诺环素，可以缓解坐骨神经炎性痛。前期实验也观察到P2Y受体激活后可以诱发背角小胶质细胞钙动员，并提高小胶质细胞活性，而P2Y12受体拮抗剂MRS2379可以通过抑制背角小胶质细胞发挥镇痛效应[6-7]。

在CCI大鼠，缩足潜伏期缩短，脊髓Iba1阳性细胞个数明显增加，细胞深染，胞体增大，突起增粗变长，其平均光密度值明显增加，说明背角小胶质细胞的激活。当鞘内注射AM1241后，CCI大鼠的缩足潜伏期相对延长，这说明，在坐骨神经结扎的神经病理性疼痛模型大鼠，大麻素CB2受体的活性变化可以影响并调节神经病理性疼痛的发生与维持。有文献报道，CB2受体表达于脊髓背角小胶质细胞，CB2受体激活有可能抑制了背角小胶质细胞的激活和随后的一些神经活性物质释放，并使得痛觉感受神经元的敏感性和兴奋性下降，痛觉过敏减轻[8]。然而，在我们的实验中，鞘内注射AM1241并不影响脊髓背角Iba1阳性细胞数目及平均光密度值，这说明CB2受体激动发挥镇痛作用，其机制可能并非抑制脊髓小胶质细胞激活。文献报道，背根神经节存在CB2受体表达，CB2受体激动剂GW 833972可以减弱辣椒素诱发的神经元钙动员[9]。另外, 在三叉神经节, 大麻素WIN 55,212-2可以激活通过PKA和PKC途径抑制辣椒素电流[10]。因此，我们推测，鞘内注射AM1241发挥镇痛作用，有可能是影响脊髓背角神经元或背根神经节的兴奋性或神经递质的释放。

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[收稿2013-04-12;修回2013-05-20]

(编辑：谭秀荣)

EffectsofintrathecalinjectionofAM1241onratthermalwithdrawallatencywithchronicconstrictioninjuryofthesciaticnerve

Zengjunwei,Chengnianqun,Tianhong,Liuxiaohong

(Department of Physiology and The Key Lab of Anesthesiology and Organ Function Protection of Guizhou, Zunyi Medical University, Guizhou Zunyi 563099, China)

ObjectiveTo investigate the effects of intrathecal injection of AM1241, the CB2 receptor selective agonist, on rat thermal withdrawal latency (TWL) and Iba1 expression in dorsal horn with chronic constriction injury (CCI) of the sciatic nerve and further explore the role of CB2 receptor in neuropathic pain.MethodsSD rats were randomly divided into three groups (n=8): sham group (sham operation), CCI group (CCI+intrathecal injection of saline) and AM1241 group (CCI+ intrathecal injection of 10-3M AM1241). The intrathecal injection was administrated for continuous 14 d. Heat hyperalgesia were evaluated by TWL detection 1, 3, 5, 7, 10 and 14 d after surgery, respectively. The Iba1 expression in dorsal horn was assessed by immunohistochemistry 7 and 14 d after surgery.ResultsTWL in CCI group were significantly lower than that in sham group 1, 3, 5, 7, 10 and 14 d after surgery (P<0. 05). Compared with the CCI group, intrathecal injection of AM1241 significantly prolonged rat TWL (P<0.01). Compared with the sham group, the Iba1 expression in dorsal horn was significantly increased 7 and 14 d after surgery (P<0.05). However, the intrathecal injection of AM1241 had no significant effects on CCI-induced increase of Iba1 expression 7 and 14 d after surgery.ConclusionIntrathecal injection of AM1241 could produce an obvious anti-allodynia activities in rat sciatic nerve CCI model but have no significant effects on Iba1 expression in dorsal horn of CCI rats.

Neuropathic pain; CB2 receptor; microglia

R322.81

1000-2715(2013)03-0189-04

国家自然科学基金资助项目( NO：31000497); 教育部科学技术重点项目 (NO：2012145);贵州省科技厅资助项目(NO：黔科合J字20102264);遵义医学院重点学科项目(NO:XZXK-20120702)。