hCG调节原代培养小鼠睾丸Leydig细胞Atrn mRNA和Atrn蛋白的表达及与睾酮分泌的相关性

明 钰，熊承良

(1.武汉轻工大学 医学技术与护理学院，湖北 武汉 430023;2.华中科技大学同济医学院 计划生育研究所，湖北 武汉 430022)

目前，对于Atrn生理作用和生化功能的研究主要聚焦于免疫应答，毛发色素形成，能量代谢，髓鞘形成[1-4]等方面。近10年来，我们通过研究发现，Atrn在大鼠睾丸间质和精曲小管中均有分布，在Leydig细胞的表达明显强于睾丸生精细胞[5]。而且，纯合子Atrn无效突变小鼠外周血生殖激素也发生改变[6]。本实验拟用hCG刺激体外培养Leydig细胞，观察其合成分泌睾酮的能力，同时检测AtrnmRNA和Atrn蛋白在此过程中的表达变化，以探讨Atrn在Leydig细胞中的生物学作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 10～12周龄雄性BALB/c 小鼠，体重23～28 g，购于华中科技大学同济医学院实验动物中心。

1.2 实验试剂 Ⅰ型胶原酶(Sigma), DMEM/F12(Gibco), Percoll(Amersham pharmacia biotech)， Trizol(Invitrogen)，3%～8%NuPAGE®Novex Tris-Acetate Gels(Invitrogen)，睾酮检测试剂盒(Cayman)，兔抗Atrn多克隆抗体由斯坦福大学医学院遗传研究室Dr.G.S.Barsh和沈士亮博士惠赠。

1.3 实验方法

1.3.1 Leydig细胞的分离和培养 小鼠断颈处死，取出双侧睾丸，剥除被膜、剔除血管，放入含胶原酶的睾丸组织消化液中，37 ℃振荡消化10～12 min(100 rpm/min)。200目筛网过滤，滤液离心后弃上清。细胞沉淀用DMEM/F12培养液重悬混匀，接种于细胞培养瓶，37 ℃培养1 h。吸出细胞悬液，缓慢加于梯度Percoll之上 (试管底部向上依次为70% 、58% 、30% 、10% Percoll液各2 mL)，4 ℃800 g离心30 min。收集第3细胞带，PBS洗2次，将细胞密度调至5×105个/mL，接种于6孔培养板。34 ℃培养24 h，经3β-HSD染色鉴定纯度在90%以上时用于实验。

1.3.2 睾酮检测 更换分别含有0，0.1，1，10，100 ng/mL hCG的无血清培养液，34℃继续培养24 h。吸取上清，1500×g离心10 min，用于测定睾酮分泌量。

1.3.3 实时荧光定量RT-PCR检测Leydig细胞AtrnmRNA表达 用Trizol提取细胞总RNA，按试剂盒说明书进行RT反应。Atrn上游引物5'-CTCCTGGTCAGTCAAGGTCTC-3，下游引物5'-TCCTGCCCCAGTATCAAATGC-3'，PCR产物长度154bp；β-Actin上游引物5'-GGGAAATCGTGCGTGACAT-3'，下游引物5'- TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3'，PCR产物长度385bp。反应条件为：95 ℃ 10 min(预变性)后进入循环(40个)：95 ℃ 变性 25 s；60 ℃ 退火30 s；72 ℃ 延伸30 s；82 ℃ 8 s采集荧光。PCR结束后，以每秒0.2 ℃的速度(从60～95 ℃升高温度)连续荧光测量做解链曲线。各处理组Leydig细胞AtrnmRNA的量是以其β-ActinmRNA 为内参标准化的相对量。

1.3.4 Western Blot检测Leydig细胞Atrn蛋白表达 Leydig细胞用RIPA裂解液提取。BCA蛋白测定试剂盒检测蛋白浓度。3%～8%NuPAGE®Novex Tris-Acetate Gels电泳分离蛋白，XCell IITMBlot Module转移蛋白至PVDF膜(30 V，1 h)。封闭后，加一抗(工作浓度1∶1000)，洗膜后加入二抗。用化学发光试剂盒显示反应条带。Atrn蛋白的相对含量以其胶片上条带光密度与同一泳道中β-Actin蛋白条带光密度的比值表示。

2 结果

2.1 hCG对Leydig细胞睾酮生成量的影响 体外原代培养的小鼠Leydig细胞对hCG的刺激有较好的反应性。刺激24 h后，与0 ng/mL hCG剂量组相比较，0.1，1，10，100 ng/mL hCG剂量组睾酮生成量都明显增加，统计学差异较大(P<0.01)，且这种反应表现为剂量依赖性。当hCG刺激浓度大于10 ng/mL时，Leydig细胞睾酮生成量的增加速度趋于平缓(见表1，图1)。

hCG(ng/mL)T(ng/mL)AtrnmRNA/β-ActinmRNAAtrn蛋白/β-Actin蛋白015．1±3．48 0．000707±0．000113 0．043774±0．003219 0．198．21±21．06∗∗0．001135±0．00011∗ 0．07763±0．013551∗∗1153．75±17．64∗∗0．001821±0．00019∗∗0．129672±0．018782∗∗ 10200．39±12．32∗∗0．002179±0．000375∗∗0．159446±0．019441∗∗ 100 213．87±29．73∗∗0．002362±0．000361∗∗0．171152±0．022085∗∗

注：与0ng/mL hCG剂量组相比*P<0.05，**P<0.01。

注：Leydig细胞在不同剂量hCG刺激下合成分泌睾酮的量增加，且表现为剂量依赖性(与0 ng/mL hCG组相比较，**P<0.01)。图1 hCG对小鼠Leydig细胞睾酮生成量的影响

2.2 hCG对Leydig细胞AtrnmRNA表达的影响 表1和图2显示，0.1，1，10，100 ng/mL hCG刺激后，Leydig细胞AtrnmRNA表达量增加(0.1 ng/mL hCG组P<0.05 , 其余剂量组P<0.01)，且这种反应表现为剂量依赖性。

注：Leydig细胞在不同剂量hCG刺激下，Atrn mRNA表达量增加，且表现为剂量依赖性(与0 ng/mL hCG组相比较，* P<0.05 ,**P<0.01)。图2 hCG对小鼠Leydig细胞Atrn mRNA表达的影响

2.3 hCG对Leydig细胞Atrn蛋白表达的影响 Western blot检测结果(见表1，图3，4)显示，对蛋白条带进行光密度定量分析，0.1，1，10，100 ng/mL hCG刺激后，Leydig细胞Atrn蛋白表达量均增加(P<0.01)，且这种反应表现为剂量依赖性(见图4)。

注：Atrn蛋白：160KD；β-Actin蛋白：40KD。图3 各剂量组Leydig细胞Western blot电泳结果

注：Leydig细胞在不同剂量hCG刺激下，Atrn蛋白表达量增加，且表现为剂量依赖性(与0 ng/mL hCG组相比较，**P< 0.01)。图4 hCG对小鼠Leydig细胞Atrn蛋白表达的影响

2.4 hCG调节原代培养小鼠睾丸Leydig细胞AtrnmRNA和Atrn蛋白表达量与睾酮生成量的相关分析 相关分析结果显示，原代培养小鼠睾丸Leydig细胞给予不同剂量hCG，睾酮生成量与Atrn蛋白表达量(r= 0.987，P<0.01)和AtrnmRNA表达量(r= 0.982，P<0.01)呈正相关。

3 讨论

小鼠Atrn基因位于2号染色体，73.9 cM区，包含29个外显子，其mRNA约为9 kb，编码1 428个氨基酸的Ⅰ型跨膜蛋白[7]。AtrnmRNA 分布广泛，它主要高表达于黑色素细胞、皮肤和中枢神经系统，包括脑、心脏、肾、肝、肺、胃和睾丸[5,7-8]。在下丘脑弓状核、内侧视前区、视上核、室旁核等GnRH神经元分布的部位，同时检测到Atrn表达[9- 10]，提示Atrn可能参与调节下丘脑、垂体、睾丸的功能。

Leydig细胞存在于睾丸间质组织，是体内雄激素的主要来源。雄激素在诱导雄性性别分化，促进性成熟，维持生殖能力和雄性特征等方面起着重要作用。Leydig细胞合成分泌雄激素的功能除了受到下丘脑和垂体调控外，还受到睾丸局部细胞分泌因子的旁分泌调节。垂体分泌的LH与睾丸Leydig细胞膜受体结合后，激活腺苷酸环化酶，形成环磷酸腺苷(cAMP)，cAMP再激活相应的蛋白酶，使底物磷酸化，产生一系列生物学效应，使Leydig细胞以胆固醇为原料合成和分泌睾酮。通过免疫电镜进行Atrn蛋白的亚细胞定位，发现Atrn表达于神经元的细胞膜，神经元和神经胶质细胞的高尔基体膜、内质网膜、线粒体膜上[9-10]。而线粒体和滑面内质网正是Leydig细胞进行合成睾酮过程的主要场所。

本实验结果显示，原代培养的Leydig细胞在hCG刺激下，睾酮生成量、AtrnmRNA和Atrn 蛋白表达量都呈现hCG剂量依赖性的增加，并且睾酮生成量无论是与Atrn蛋白表达量还是和AtrnmRNA表达量都呈正相关。由此我们推测Atrn可能与hCG刺激的睾酮合成分泌存在着联系。但是，本实验尚无法说明是hCG刺激睾酮产生后引起Atrn表达增加，还是Atrn参与了hCG刺激的睾酮合成分泌过程，这有待进一步的研究。

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