李 芳，范晓莉，雷镇华，戴宝全，王凤月，侯晓晖

(遵义医科大学 细胞生物学教研室，贵州 遵义 563099)

随着现代工业的发展，锰矿石的开采、锰铁冶炼、汽油抗爆剂及干电池的使用大幅度增加，职业暴露随之增加，这也很大程度上增加了锰中毒的机率。因而，过量的锰也成为一种职业危险因素和环境污染物，其可通过呼吸道、消化道和皮肤接触直接进入机体，造成机体多种脏器的损伤[1-2]。现有研究表明锰暴露会在一定程度上导致雄性动物的生殖器官损伤，锰可通过血睾屏障(Blood-testis barrier,BTB)导致睾丸生精功能障碍，表现为组织萎缩、精子活力降低及数目减少等[3-4]。然而，锰是如何通过BTB造成生精功能障碍的作用机制尚不清楚。研究发现，Claudin1作为BTB紧密连接的重要因子之一，在热应激处理后的小鼠睾丸支持细胞(TM4)中表达水平有所降低，可通过添加代谢产物肉碱得以恢复[5]。

九香虫是一种重要的中药昆虫，《中华人民共和国药典》载其具有“理气止痛、温中助阳”之功效，用于肾虚阳痿和腰膝酸痛等症[6]。同时，九香虫具有抗菌、抗癌和抗炎等作用[7-10]，亦可修复锰导致的大鼠生殖器官损伤并影响锰在体内的分布[11-13]。本研究先利用锰造成雄性SD大鼠生殖器官损伤，再用九香虫的石油醚提取物(CcE)进行干预，最后对大鼠的行为学、生殖器官脏器系数、精子数目及Claudin1的分布和表达情况进行评价，以探讨CcE对锰中毒大鼠生殖损伤的干预效果及Claudin1在其中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 成年雄性SD大鼠(SPF级)50只，购自陆军军医大学大坪医院实验动物中心(许可证号：SCXK[渝]2012-0005)。

1.1.2 九香虫提取液 中药九香虫购于遵义市百颐医药公司，取一定量干燥的九香虫打成粗粉后，加入一定体积的石油醚，经冷浸、搅拌、旋转蒸发后减压回收，然后利用真空冷冻干燥获得九香虫浸膏，最后用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制成100 mg/mL的CcE溶液，保存于-20 ℃冰箱备用，使用时按照需要进行稀释。

1.1.3 主要试剂 Claudin1多克隆抗体购于Abcom，β-actin鼠单克隆抗体购于Proteintech，免疫组化试剂盒购于北京中杉金桥生物技术公司，总蛋白定量测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所，其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 造模及干预实验 实验动物随机分为空白对照组(A)、锰模型组(B)、CcE低剂量干预组(C)、CcE中剂量干预组(D)和CcE高剂量干预组(E)。除空白对照组给予生理盐水外，其余各组按照15 mg/kg腹腔注射氯化锰溶液，连续30 d；同时，CcE各剂量组分别按照50、100、200 mg/kg灌胃CcE，连续30 d。

1.2.2 行为学观察 按照常规方法[11]制备去势雌鼠，并于术后2周用于实验。去势雌鼠在合笼前肌肉注射苯甲酸雌二醇和黄体酮获得发情雌鼠，合笼后在红光灯下观察15 min，记录雄鼠的扑捉、骑跨、插入及射精等交配活动次数。

1.2.3 睾丸和附睾脏器系数及精子数目测定 大鼠注射水合氯醛麻醉后，取下双侧睾丸和附睾进行称重，并计算其脏器系数，即脏器重量(g)/体重(g)×100%。

将左侧附睾置于5 mL PBS缓冲液中剪碎尾部，再放入37 ℃水浴箱中孵育15 min后制成精子混悬液，取10 μL精子混悬液与90 μL PBS混合后再取出10 μL置于血球细胞计数板上，计算总精子数n，则精子数为n×25/5×稀释倍数(10)×107/mL。

1.2.4 睾丸组织锰含量测定 按照常规方法[13]硝化睾丸组织并逐级稀释，利用石墨炉原子吸收光谱法检测睾丸中的锰含量，并绘制标准曲线。锰标准溶液纯度为99.99%，浓度为1 000 mg/L，购自上海市计量测试技术研究院。

1.2.5 睾丸形态学观察 按照常规方法进行睾丸组织固定、包埋、切片及HE染色，在光镜下观察睾丸组织生精小管的细胞排列及结构完整性。

1.2.6 Claudin1蛋白表达 IHC：按照常规方法[14]将石蜡切片进行脱蜡、脱水等步骤，按免疫组化试剂盒说明书进行操作，一抗为Claudin1多克隆抗体，二抗为生物素化羊抗兔IgG。

Western blot：按照常规方法[14]提取睾丸组织总蛋白，BCA法测蛋白浓度，按照蛋白上样量60 μg进行电泳、转膜、封闭等步骤，然后加入Claudin1(1∶1 000)、内参β-actin(1∶5 000)以及山羊抗兔二抗(1∶2 000)，凝胶成像系统曝光并保存图片后定量分析。

2 结果

2.1 行为学 锰模型组较空白对照组大鼠的交配行为各项指标(扑捉、骑跨、插入及射精)均明显降低(P<0.05)；CcE各剂量干预组较锰模型组大鼠的上述指标均明显升高(P<0.05，见表1)。

表1 CcE对锰暴露雄性大鼠交配行为的影响

2.2 睾丸和附睾脏器系数以及精子数目 锰模型组较空白对照组大鼠的睾丸和附睾脏器系数以及精子数目均明显减少(P<0.05)；CcE各剂量干预组较锰模型组大鼠的上述指标均有一定程度增加(见表2)。

表2 CcE对锰暴露雄性大鼠睾丸和附睾脏器系数及精子数目的影响

2.3 睾丸组织锰含量 锰模型组较空白对照组大鼠的睾丸组织锰含量明显增高，具有统计学意义(P<0.05)；CcE各剂量干预组较锰模型组大鼠的睾丸组织锰含量均有所降低，其中CcE低剂量干预组明显降低，具有统计学意义(P<0.05，见图1)。

A：空白对照组；B：锰模型组；C：CcE低剂量干预组；D：CcE中剂量干预组；E：CcE高剂量干预组；*：与空白对照组相比，P<0.05；#：与锰模型组相比，P<0.05。

2.4 睾丸组织形态学

2.4.1 HE染色 空白对照组大鼠的生精小管排列整齐、结构完整(见图2A)。锰模型组大鼠的生精小管上皮萎缩、排列紊乱，生精小管管腔及间隙异常扩大(见图2B)。CcE各剂量干预组大鼠的睾丸组织得到一定程度修复，生精小管上皮细胞排列有序，管腔缩小(见图2C～E)。

A：空白对照组；B：锰模型组；C：CcE低剂量干预组；D：CcE中剂量干预组；E：CcE高剂量干预组。

2.4.2 Claudin1分布部位 空白对照组Claudin1在生精小管中有较高的阳性表达，其中生精小管基膜处呈连续阳性表达(见图3A)。与空白对照组相比，锰模型组Claudin1在生精小管中表达明显减少，仅生精小管基膜处呈不连续阳性表达(见图3B)。与锰模型组相比，CcE各剂量干预组Claudin1在睾丸组织表达均明显增加，其中CcE中、高剂量组生精小管基膜处呈连续阳性表达，基本恢复至空白组水平(见图3C～E)。

A：空白对照组；B：锰模型组；C：CcE低剂量干预组；D：CcE中剂量干预组；E：CcE高剂量干预组。

2.5 Claudin1蛋白表达 与空白对照组相比，锰模型组大鼠睾丸组织Claudin1蛋白表达量显着降低(P<0.05)；CcE中、高剂量干预组大鼠睾丸组织Claudin1蛋白表达量显着增加(P<0.05，见图4)。

A：空白对照组；B：锰模型组；C：CcE低剂量干预组；D：CcE中剂量干预组；E：CcE高剂量干预组；*：与空白对照组相比，P<0.05；#：与锰模型组相比，P<0.05。

3 讨论

随着人们健康意识的增强，越来越重视环境污染对人和动物的负面影响及其干预方法[15]。与此同时，锰作为环境污染物之一对人类健康的损伤及其治疗方法也逐渐被提上日程。雄性动物在锰暴露的过程中，其睾丸组织是敏感性最高的脏器之一[2]。锰可穿过BTB并蓄积于睾丸组织内，导致生精小管损伤，使睾丸功能受到抑制，进而抑制精子的发生[16]。现代医学提倡早发现、早治疗，金属锰作为有毒有害物质进入人体后到达敏感器官，如果有药物能够有效清除则会减轻锰对机体的损伤。本研究中建模成功的锰中毒大鼠在利用CcE干预后，大鼠睾丸组织中锰含量显着降低，说明CcE可能有清除睾丸组织中锰的作用，但具体机制尚不清楚。

目前，已有许多学者开展九香虫及其提取物对锰中毒大鼠的干预研究，涉及睾丸、肝脏等多个器官，对大鼠的组织形态、精子数目、脏器系数、行为学、激素水平等均有非常好的修复作用，可能是通过调节凋亡相关基因p53、Bax、Bcl-2等表达，阻抑凋亡发生，或是通过调节超氧化物歧化酶等抑制过氧化作用而实现[12,14,17]。但是对于锰是如何进入睾丸组织以及对血睾屏障重要组成部分支持细胞的研究尚属空白，本研究除了提供睾丸形态学、行为学、锰含量等常规修复结果外，还从BTB重要因子Claudin1入手，通过免疫组化和Western blot检测得知Claudin1在CcE干预后表达水平有所上升且在支持细胞周围分布增多。这也从另一个角度证实锰中毒后支持细胞受损且BTB破坏，后者可以通过CcE的修复有所改善。

此外，本研究中CcE低剂量组清除锰的作用优于其他剂量组，而Claudin1在CcE中、高剂量组表达更接近正常大鼠，说明不同浓度CcE在干预效果方面有所不同。因而，对于CcE的最佳使用浓度或者不同作用时的最优剂量尚不明确，需要继续深入研究。

综上所述，九香虫石油醚提取物干预锰中毒大鼠，可以降低睾丸组织中的锰含量，改善大鼠的生殖能力和交配能力，以及修复睾丸组织Claudin1的表达。因此，CcE对锰中毒大鼠的干预作用可能与修复BTB重要因子Claudin1有关。