邓 莉，田 静
(恩施土家族苗族自治州中心医院 脾胃科，湖北 恩施 445000)
结肠癌(Colon cancer)发病率位居第3位，也是导致癌症死亡的主要原因之一。流行病学调查发现，蔬菜、水果和豆类的摄入量与肿瘤发病率和死亡率呈负相关；如多吃葡萄、花生和浆果会大大降低癌症发生的风险，包括结肠癌和前列腺癌[1]。白藜芦醇(Resveratrol，RES)是一种植物抗毒素，存在于多种植物中，对肿瘤细胞具有较好的化疗作用[2]。目前虽已有一些关于RES对结肠癌细胞影响的研究，包括RES对人结肠癌细胞有明显的抑制作用[3]，RES通过调节线粒体/内源性和受体/外源性凋亡途径以及非依赖性caspase途径的多个靶点介导凋亡[4]等，但对正常细胞影响的研究很少，故有必要了解RES在抗癌细胞的同时对病灶周围正常细胞的毒性作用。
丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPKs)属于丝氨酸/苏氨酸激酶的超家族，可将各种胞外信号传递至细胞核而发挥重要作用[5]。众所周知，MAPKs构成一个大的分子信号网络，调节各种生理过程，如细胞生长、分化、细胞周期和细胞凋亡[6-7]。最近的数据表明，骨髓细胞瘤病毒癌基因(c-Myc)也是调节细胞增殖和细胞周期机制的核心和关键[8-9]。鉴于MAPKs和c-Myc表达在细胞应对外界刺激中的关键作用，本文考察了RES对结肠上皮NCM460细胞和结肠癌HCT116细胞生长、凋亡、MAPK信号通路及c-Myc蛋白表达的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 白藜芦醇购自Sigma公司，批号：501-36-0；DMEM培养基、胎牛血清(FBS)购自英国Gibco公司；Erk1/2(批号ab2098361)、p-Erk1/2(批号ab1109632)、P38 MAPK(批号ab1090263)、p-P38 MAPK(批号ab1238790)、JNK1/2(批号ab1097864)、p-JNK1/2(批号ab1437890)和c-Myc(批号ab1243784)抗体购自英国Abcam公司；羊抗兔二抗购自上海谷歌生物有限公司；ECL显影液购自北京百奥莱博科技有限公司(批号GL1055)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自杭州碧云天生物公司(批号C1062S)。
1.2 细胞培养及药物处理 人结肠上皮NCM460细胞系和结肠癌HCT116细胞系来源于武汉杰诺公司，采用DMEM完全培养液(含10%FBS、1%的100 U/mL青霉素和100 g/mL链霉素)孵育细胞，培养温度37 ℃、CO2浓度为5%。将对数期细胞(1×106个/孔)接种于6孔板孵育24 h，然后采用RES(0、10、20、40 μM)处理细胞72 h，培养条件为温度37 ℃、CO2浓度为5%的培养箱。
1.3 细胞形态和克隆分析 细胞经“1.2”项药物处理后，倒置显微镜观察细胞形态，并拍照。并随机选择10个视野，计数细胞，计算平均作为细胞的克隆数。
1.4 细胞周期分布和凋亡率检测 细胞经“1.2”项药物处理后，收集各组细胞，PBS清洗2次，收集细胞，采用2.0 mg/mL的PI染液和RNase I染色30 min，流式细胞仪立即检测细胞周期分布情况。另外，收集细胞，PBS重悬后，分别加入Annexin-V FITC和PI处理细胞(按照试剂盒操作说明书进行)，最后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
1.5 蛋白相对表达水平分析 细胞经“1.2”项处理后，PBS清洗细胞3次，收集各组细胞裂解、超声破碎、12 000 r/min离心12 min后收集上清，BCA试剂盒测定上清蛋白浓度。每个样本上样50 μg进行凝胶电泳，待蛋白完全分离后进行转膜实验。结束后加入5%脱脂奶粉封闭液于摇床上室温封闭1h后，分别加入Erk1/2、p-Erk1/2、P38 MAPK、p-P38 MAPK、JNK1/2、p-JNK1/2和c-Myc抗体(体积稀释比例均为1∶1 000)4 ℃反应过夜。次日TBST洗膜3次后加入HRP标记的山羊抗兔IgG(体积稀释比例为1:3 000)，室温反应1 h。再用TBST洗膜3次，每次10 min，以ECL试剂显影后进行蛋白条带灰度值分析。
1.6 统计学分析 采用SPSS 20.0软件统计，两两组间比较采用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 RES对NCM460和HCT116细胞形态和生长的影响 NCM460和HCT116细胞经RES处理后，两种细胞均逐渐从培养皿底部收缩和分离，并且NCM460细胞形态明显优于HCT116细胞(见图1A)。从细胞克隆数比较可见，RES处理可明显减少NCM460和HCT116细胞克隆数，而HCT116细胞克隆数降低得更为显着(P<0.05，见图1B)。
与0 μM的RES组比较，*：P<0.05；A：细胞克隆图；B：细胞克隆计数。图1 RES对NCM460和HCT116细胞形态和生长的影响
2.2 RES对NCM460和HCT116细胞周期分布的影响 经20、40 μM的RES处理72 h后，G1期分布的NCM460细胞相对于0 μM的RES组明显降低，而G2期细胞分布则明显增多(P<0.05)。经10、20、40 μM的RES处理72 h后，G1期分布的HCT116细胞相对于0 μM的RES组明显降低，而G2期细胞分布则明显增多(P<0.05)。进一步比较发现，40 μM的RES处理后相比于0 μM的RES组NCM460细胞G1期细胞数降低11%、而G2期细胞数增多了0.91倍；20、40 μM的RES处理后相比于0 μM的RES组，HCT116细胞G1期细胞数分别降低20%和33%，而G2期细胞数分别增高了0.43倍和0.91倍。
与0 μM的RES组比较，*：P<0.05。图2 RES对NCM460和HCT116细胞周期分布的影响
2.3 RES对NCM460和HCT116细胞凋亡的影响 经10、20、40 μM的RES处理72 h后，HCT116细胞凋亡率相对于0 μM的RES组分别增高了3.1倍、7.9倍和13.1倍(P<0.05)。10、20 μM的RES处理72 h后，NCM460细胞凋亡率相对于0 μM的RES组没有发生明显变化(P>0.05)，而40 μM的RES处理72 h后，NCM460细胞凋亡率增高了2.9倍(P<0.05)，见图3。
与0 μM的RES组比较，*：P<0.05。图3 RES对NCM460和HCT116细胞凋亡的影响
2.4 RES对NCM460和HCT116细胞中MAPK信号通路和c-Myc蛋白表达的影响 为了考察NCM460和HCT116细胞中增殖相关信号通路的作用，实验分析了10、20、40 μM的RES处理细胞72 h后MAPK的磷酸化状态和c-Myc表达。Western blot实验结果显示，RES处理后NCM460和HCT116细胞中Erk1/2、p-P38 MAPK、P38 MAPK和JNK1/2并没有发生明显变化(P>0.05)。另外，NCM460细胞中p-Erk1/2蛋白表达水平随着RES浓度升高而增多(P<0.05)，而在HCT116细胞中没有发生明显变化(P>0.05)。在HCT116细胞中，p-JNK1/2表达水平随RES浓度升高而增高，c-Myc表达水平则降低(P<0.05)；而p-JNK1/2和c-Myc蛋白表达水平在HCT116细胞中没有发生明显变化(P>0.05，见表1、图4)。
图4 RES对NCM460和HCT116细胞中MAPK信号通路和c-Myc蛋白表达的影响
表1 各组间MAPK信号通路和c-Myc 表达水平的比较
3 讨论
最近研究综述RES可以抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞，降低癌细胞的转移和侵袭，增强肿瘤细胞的化疗/放疗敏感性，除此对糖尿病也有改善作用。基于这些数据，RES被认为是治疗肿瘤的一种潜在的抗癌剂[10]。已有较多报道指出，RES抑制肿瘤生长，也揭示其化疗保护的分子机制[11]。然而，本研究首次比较RES对肺致癌性结肠上皮细胞和致癌性结肠癌细胞的影响。成年哺乳动物中，肠道和结肠上皮细胞是最容易自我更新的组织(3～5 d)。本研究发现，10～40 μM的RES处理细胞72 h可减少致瘤性HCT116结肠癌细胞G1期分布，并且对HCT116细胞增殖的抑制作用明显优于非致瘤性NCM460结肠上皮细胞。同样，10～40 μM的RES对HCT116细胞有明显的凋亡诱导作用，但对NCM460细胞无明显作用。有趣的是发现RES抑制结肠癌细胞生长，而对非致瘤性结肠细胞影响较小。这一观察结果与抗癌药物通常能有效抑制肿瘤细胞生长而不是正常细胞生长的事实是一致的。
因为MAPK信号通路在细胞增殖、分化和存活中起着关键作用[12]，本实验也发现，RES对NCM460和HCT116细胞中MAPK信号活性的影响也有差异。JNK1/2、P38 MAPK和Erk1/2是最重要的MAPK信号通路[13]。通常认为生长因子激活的Erk1/2是细胞存活的前期，而P38 MAPK和JNK1/2信号是细胞应激反映的结果，被认为是细胞凋亡的介质[14]。本研究结果证实，RES处理可上调NCM460细胞中Erk1/2的磷酸化，而对HCT116细胞中没有影响。另外，虽然P38 MAPK信号的磷酸化没有发生变化，但是RES会增加HCT116细胞中JNK1/2磷酸化。
为了进一步理解上述分子机制，实验检测c-Myc蛋白表达，结果提示RES抑制HCT116细胞中c-Myc蛋白表达，对NCM460细胞没有影响。由于c-Myc参与细胞增殖和凋亡过程，在肿瘤的形成和发展中起着关键作用[15-16]，而且已有研究表明，Erk1/2通路对细胞分裂通过G1期是必不可少的，而Erk1/2和c-Myc激活对于驱动细胞从G0期到G2期也是必须的[17]。我们的实验结果显示，RES处理也明显诱导HCT116细胞凋亡和G1期细胞分布减少，但对NCM460细胞相关的作用效应明显较弱。因此，非致瘤性结肠上皮细胞和致瘤性结肠癌细胞对RES的敏感性存在差异，至少部分解释了RES抗癌作用的分子基础。
