胃癌组织中LncRNA NBAT1的表达及意义

陈 禺，李 军，余壮明，李 合，周晓华，黄 亮

(海南医学院第一附属医院 普通外科，海南 海口 570102)

胃癌为较常见的恶性肿瘤，虽然手术联合放化疗可改善早期胃癌患者预后，但对于晚期胃癌，患者预后往往较差[1-2]，因此，探究胃癌的分子生物学特点，明确其早期诊疗靶标意义重大。长链非编码RNA(LncRNA)为不编码蛋白质RNA，其主要表达于真核细胞[3]。成神经细胞瘤相关转录本1(Neuroblastoma associated transcript 1,NBAT1)为新近鉴定的功能性LncRNA，其可作为生物标记物预测神经母细胞瘤患者预后[4]。本课题组前期利用谱芯片对人胃癌细胞系HGC-27肿瘤球细胞与贴壁细胞中的LncRNA NBAT1进行检测，发现其表达存在差异性。因此，本研究进一步探讨胃癌组织中LncRNA NBAT1的表达及意义，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 一般材料 将2018年7月至2019年12月期间，本院收治的88例经手术病理确诊的原发性胃癌患者纳入研究，年龄37～72岁，平均年龄(59.13±4.29)；临床分期：I期～II期30例，III期～Ⅳ期58例；51例出现淋巴结转移；33例发生深层浸润。所有患者均签署知情同意书，符合医院伦理要求。收集术后胃癌组织及癌旁组织(距癌组织>2 cm)作为样本，癌旁组织经病理证实为正常胃组织。采集新鲜样本后，经液氮冷冻，置于-80℃冰箱。

1.1.2 主要试剂与设备 RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒购自美国ABI公司； qRT-PCR检测试剂盒购自广州锐博生物科技有限公司；实时荧光定量PCR仪购自ABI公司；紫外分光光度计购自赛默飞公司；LncRNA NBAT1引物及内参β-ACTIN委托上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及逆转录 根据RNA提取试剂盒(生产厂家：美国Invitrogen公司)说明书操作，取5m3样本超声匀浆，经DEPC水溶解后检测RNA纯度及浓度，另取1 μL RNA检测完整性。根据逆转录试剂盒(生产厂家：美国Invitrogen公司)说明书操作(反应体系20μL)：RNA样品 2 μL、引物1 μL、逆转录酶1 μL、5×RT 缓冲液4 μL、GAPDH 反向引物1μL、RNase 抑制剂 0.5μL、dNTP 混合物(10 mM)1 μL、不含RNase的 H2O 9.5 μL。反应条件：42 ℃ 30 s，35 ℃ 15 min，92℃ 1min，4 ℃ 5 min，产物置于-20 ℃。

1.2.2 实时定量聚合酶链反应 根据试剂盒说明书操作(反应体系25 μL)：引物2 μL、稀释的cDNA2 μL、SYBR 12.5 μL、ddH2O 8.5 μL。反应条件：45 ℃ 1 min，92 ℃ 30 s，55℃ 1 min，72 ℃ 20 s，40个循环。LncRNA NBAT1上游引物：5’-CGGCTCCAACGATCTGTTCT-3’，下游引物：5’-ACTCATAATCATGCTGCGCG-3’；β-ACTI上游引物：5’-AGCGGTTGTAGGACGTTGATG-3’，下游引物：5’-GGTCGGGTATGTGGACCAA-3’。LncRNA NBAT1的相对表达量根据公式 2-ΔΔCt值(LncRNA NBAT1)- 2-ΔΔCt值(β-ACTIN)计算[5]。

2 结果

2.1 胃癌组织中LncRNA NBAT1的表达量分析 胃癌组织中LncRNA NBAT1的相对表达量为(2.35±0.51)，明显低于癌旁组织(5.03±0.74)，二者比较差异具有统计学意义(t=27.974，P<0.001)，如图1所示。

*：与癌旁组织组相比，P<0.001。图1 组织中LncRNA NBAT1的相对表达量

2.2 LncRNA NBAT1的表达量与胃癌患者临床特征的关系 LncRNA NBAT1的表达与胃癌临床分期、浸润程度、淋巴结转移及脉管癌栓有关(P<0.05，见表1)。

表1 LncRNA NBAT1的表达量与临床特征的关系

2.3 ROC曲线分析 以LncRNA NBAT1表达量为连续变量，以是否为胃癌组织为因变量，绘制ROC曲线，NBAT1临界值为2.35。由ROC曲线可知，LncRNA NBAT1诊断胃癌的曲线下面积为0.805(95%CI：0.741～0.926)，约登指数为0.427，诊断特异度为81.54%，敏感度为90.08%，如图2所示。

图2 LncRNA NBAT1诊断胃癌的ROC曲线

3 讨论

临床研究显示，LncRNA普遍表达于真核细胞中，其具有丰富的生物学功能[6]。有文献报道，胃癌组织中多种LncRNA表达异常，提示LncRNA可能参与胃癌的发生进展[7-8]。胃癌为临床常见的恶性肿瘤，尽管胃癌治疗规范己逐步完善，但总体治疗效果并不理想[9-10]。因此，探寻胃癌的分子生物学机制，明确其早期诊疗靶标尤为重要。本课题组前期利用Affymetrix LncRNA表达谱芯片检测了人胃癌细胞系HGC-27肿瘤球细胞与贴壁细胞存在差异表达的LncRNA NBAT1。有研究报道， NBAT1可能是一种肿瘤抑制因子，可通过调控Arget抑制细胞增殖和侵袭，并可通过激活NRSF/REST影响神经元分化[11]。本研究发现，胃癌组织中LncRNA NBAT1的相对表达量明显低于癌旁组织，LncRNA NBAT1在胃癌组织中呈低表达。结果表明，NBAT1可能与胃癌恶性程度有关， NBAT1表达的缺失可能会促进胃癌进展。因此，临床监测胃癌组织中LncRNA NBAT1的表达有助于判断胃癌的发生进展，可为临床治疗方式的选择提供参考。

非小细胞肺癌组织中NBAT1的表达显着降低，其表达水平有助于评价肿瘤进展和预后，可能是非小细胞肺癌新治疗靶点[12]。邵凤平[13]研究发现，LncRNA NBAT1在膀胱癌细胞株中呈低表达，下调NBAT1基因表达，可提高膀胱癌细胞增殖活力，促进细胞迁移及侵袭。Mondal等[14]学者研究发现，NBAT1为肿瘤抑制因子，其在神经母细胞瘤组织中表达异常。由以上研究推测，LncRNA NBAT1可能是恶性肿瘤的治疗靶点。本研究进一步分析了LncRNA NBAT1的表达量与胃癌患者临床特征的关系，结果提示，LncRNA NBAT1的表达与胃癌临床分期、浸润程度、淋巴结转移及脉管癌有关，且临床分期越高、浸润程度越深、发生淋巴结转移及脉管癌的组织中LncRNA NBAT1表达越低，表明LncRNA NBAT1的表达与胃癌的发生、转移有关，其可能在胃癌中发挥抑癌作用，其可能对评估胃癌的发生进展有一定临床价值。有学者研究报道，NBAT1在胃癌组织中显着下调，其表达下降与分化不良、肿瘤分期及淋巴结转移有关[15]。由以上研究结果推测，LncRNA NBAT1可作为胃癌临床诊疗的潜在生物学标记物。

ROC曲线分析提示，LncRNA NBAT1诊断胃癌的曲线下面积为0.805(95%CI：0.741～0.926)，约登指数为0.427，诊断敏感度为90.08%，特异度为81.54%。结果提示，LncRNA NBAT1对胃癌的诊断敏感性和特异性均较高，其表达与胃癌的恶性程度密切相关。王顺等[16]学者通过对68例肝癌患者进行研究，结果显示肝癌组织中LncRNA NBAT1表达下调，可能与肝癌的发生进展有关。Weidle等[17]学者发现，包括LncRNA NBAT1在内的多种LncRNA都具有体外和体内转移相关的数据及临床意义。另有学者报道，NBAT1在肾癌细胞中显着下调，可抑制肾癌细胞增殖，迁移和侵袭[18]。由此可知，LncRNA NBAT1在多种恶性肿瘤的发生发展过程中扮演重要角色。

综上所述，胃癌组织中LncRNA NBAT1呈低表达，且其表达水平可能与胃癌的发生进展有关，LncRNA NBAT1可能在胃癌的发生进展过程中发挥抑癌作用。