基于指纹图谱与多指标含量测定的黔产香榧假种皮质量控制研究

田 鑫，张 艳，余 明，曹泮相，张建永，段灿灿

(1.遵义医科大学 药学院药物分析教研室，贵州 遵义 563099；2.遵义医科大学 基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义 563099；3.贵州务川万年峰农业开发有限公司，贵州 遵义 564300)

香榧(TorreyagrandisFort.)，为中国原产树种、国家二级保护植物，主产于江苏南部、浙江等地，安徽、贵州也有引种。香榧假种皮为香榧种子壳外包被的肉质组织，暂未被2020版《中国药典》收录。假种皮是香榧的重要非药用部位，具有产量大、易获得等特点，然而目前市场多将其丢弃。现代研究发现香榧假种皮的化学成分复杂，主要包括黄酮类[1-2]、木脂素类[3]、萜类和挥发油[4]、脂肪[5-6]等类型[7-8]。香榧假种皮具有抗菌[9]、驱虫[10]、抗病毒及抗肿瘤[11-12]等多种药理作用。目前关于假种皮的研究多集中于挥发油，且开发了相关日化产品，如香榧面膜、香榧精油皂和香榧洗发水等。关于其质量控制项的研究较少，未能体现其品质，影响了对假种皮的进一步开发利用。

中药指纹图谱可以从多角度展现中药多种成分的特征和质量变化情况，对中药的种属、真伪和优劣进行直观鉴定，具有整体性和模糊性的特点，能够对中药的一致性和稳定性给予科学评价[13]。中药成分类型复杂多样，仅用单一指标性成分控制中药质量的方法明显无法充分表明中药整体质量信息，也无法反映中药有效性和安全性情况[14]。只有将中药指纹图谱技术和多指标含量测定方法相结合，才能够为中药的品质保障提供有效手段。

贵州省目前引种香榧树的面积已达到5.1万亩，主要分布在遵义市，香榧的种子作为主要产品初步形成了产业链，而假种皮的利用相对不足，阻碍了对香榧资源的进一步开发。因此，本研究拟建立黔产香榧假种皮高效液相色谱(HPLC)指纹图谱及多指标含量测定方法，为黔产香榧假种皮的质量控制和开发提供科学依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 Agilent 1260 Infinity高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；超声波清洗器(宁波新艺超声设备有限公司)；沃特浦超纯水设备(四川沃特尔水处理设备有限公司)；十万分之一电子天平、电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)。

1.2 试剂 甲醇(色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，甲醇(分析纯，成都金山化学试剂有限公司)，乙酸(色谱纯，赛默飞世尔科技公司)，对照品苯甲酸(分析纯，纯度≥98%，批号3875，上海诗丹德标准技术服务有限公司)，异鼠李素(分析纯，纯度≥98%，批号AF20111816，成都埃法生物科技有限公司)，芹菜素(分析纯，纯度≥98%，批号AF9032008，成都普思生物科技股份有限公司)，金松双黄酮(分析纯，纯度≥98%，批号DSTDJ005201，德思特生物技术有限公司)，异银杏素(分析纯，纯度≥98%，批号DST200424-191，德思特生物技术有限公司)。

1.3 样品信息 18批香榧假种皮采自贵州省遵义市务川县石朝乡，经遵义医科大学药学院药物分析教研室张建永教授鉴定为红豆杉科榧树属榧树TorreyagrandisFort.的假种皮，具体样品信息见表1。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 HPLC色谱条件 色谱柱为：Agilent Eclipse Plus C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相为：甲醇(A)-0.06%醋酸-水溶液(B)；采用梯度洗脱，具体洗脱程序如表2；检测波长为：270 nm；流速为：1.0 mL/min；柱温为：30 ℃；进样量为：5 μL。

表2 HPLC梯度洗脱表

2.2 HPLC指纹图谱研究

2.2.1 供试品溶液的制备 香榧假种皮干燥后粉碎，称取香榧假种皮粉末1.0 g于锥形瓶中，加入15 mL甲醇，用电子天平称重后，摇匀，超声60 min，冷却至室温，再次称重，以甲醇补足损失的重量，摇匀后过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，备用。

2.2.2 黔产香榧假种皮指纹图谱的方法学考察

(1)仪器精密度的试验：取香榧假种皮供试品溶液，在上述色谱条件下进样6次，记录18个共有峰的保留时间和峰面积，并分别计算相对标准偏差(RSD)值，考察色谱峰相似度的一致性。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版本)，进行相似度评价。结果显示，6次测定的18个共有峰保留时间的RSD值不超过0.76%，各色谱峰的共有峰面积RSD值不超过3.40%，相似度为1.000，仪器的精密度良好。

(2)重复性的试验：称取6份香榧假种皮粉末，按“2.2.1”项下方法制成供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下连续进样分析，记录18个共有峰的保留时间和峰面积，并分别计算它们间的 RSD 值，考察色谱峰相似度的一致性。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统，进行相似度评价。结果显示，6次测定的18个共有峰保留时间的RSD值不超过0.22%，各色谱峰的峰面积RSD值不超过2.51%，相似度达到1.000，方法重复性良好。

(3)稳定性试验：取一份香榧假种皮粉末按“2.2.1”项下方法制成供试品溶液，分别在0、4、8、12、16、20、24 h连续进样7次，记录18个主要共有峰的保留时间和峰面积，并分别计算RSD 值，考察色谱峰相似度的一致性。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统，进行相似度评价。结果显示，18个共有峰保留时间的RSD值不超过0.30%，各色谱峰的峰面积RSD值不超过2.49%，相似度达到1.000，表明香榧假种皮样品在24 h内较稳定。

2.2.3 黔产香榧假种皮样品HPLC指纹图谱的建立 取不同批次黔产香榧假种皮粉末，按上述方法制备供试品溶液，在色谱条件下进样分析。共选出了18个共有峰(18个共有峰的峰面积之和大于总峰面积的93.25%)，将S1作为对照图谱，时间窗宽度是0.1，最终得到18批黔产香榧假种皮样品重叠的HPLC指纹图谱，如图1～2。

峰4：芹菜素；峰15：金松双黄酮。

图2 18批黔产香榧假种皮样品的HPLC指纹图谱

2.2.4 黔产香榧假种皮样品HPLC指纹图谱相似度评价 采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版本)，用中位数矢量法计算18批黔产香榧假种皮的指纹图谱与对照指纹图谱的相似度，计算得到18批香榧假种皮相似度为0.995～1.000，结果见表3，显示相似度良好。

表3 18批黔产香榧假种皮样品指纹图谱相似度的结果

2.3 香榧假种皮中5种化学成分的含量测定 采用HPLC-DAD对各对照品与香榧假种皮供试品溶液进行全波长扫描，并对它们的色谱图进行比对后，定性了黔产香榧假种皮中可能存在苯甲酸、异鼠李素、芹菜素、金松双黄酮和异银杏素，本部分对黔产香榧假种皮中的这5种成分进行定量分析。

2.3.1 溶液的配制 单一对照品溶液的配制：分别准确称取适量苯甲酸、异鼠李素、芹菜素、金松双黄酮、异银杏素于5个25 mL的容量瓶中，用甲醇定容，充分振摇，得到单一对照品贮备液，其浓度分别是0.169、0.764、0.246、0.088、0.142 mg/mL，过0.22 μm微孔滤膜，备用。

混合对照品溶液①的配制：取5个单一对照品溶液各2.0 mL于试管中，挥干溶剂，加入2.0 mL甲醇复溶，振荡摇匀，即得混合对照品溶液①，过0.22 μm微孔滤膜，备用。

混合对照品溶液②的配制：取5个单一对照品溶液各1.0 mL于5 mL容量瓶中，混合摇匀，即得对照品溶液②，过0.22 μm微孔滤膜，备用。

供试品溶液的配制：同“2.2.1”项下方法。

2.3.2 色谱条件 检测波长：230、255、270、330 nm，其余条件同“2.1”项下内容。

2.3.3 专属性的考察 分别将空白溶剂(甲醇)、苯甲酸对照品溶液、异鼠李素对照品溶液、芹菜素对照品溶液、金松双黄酮对照品溶液、异银杏素对照品溶液、供试品溶液按色谱条件进样测定。由图3～6可知，香榧假种皮供试品溶液所测成分苯甲酸(230 nm、12.534 min)、异鼠李素(255 nm、20.109 min)、芹菜素(270 nm、20.097 min)、金松双黄酮(270 nm、43.059 min)、异银杏素(330 nm、36.915 min)色谱峰的保留时间和对照品溶液中测定的各成分保留时间相一致，溶剂和其他成分对测定均无干扰。可见专属性良好。

A：空白溶剂(甲醇)；B：苯甲酸；C：供试品溶液；1：苯甲酸;波长230 nm。

A：空白溶剂(甲醇)；B：异鼠李素；C：供试品溶液；2：异鼠李素;波长255 nm。

A：空白溶剂(甲醇)；B：芹菜素；C：金松双黄酮；D：供试品溶液；3：芹菜素；4：金松双黄酮;波长270 nm。

A：空白溶剂(甲醇)；B：异银杏素；C：供试品溶液；5：异银杏素;波长330 nm。

2.3.4 线性关系考察 将混合对照品溶液①按一定比例稀释，按“2.1”项下色谱条件进样。用浓度作为横坐标(X)，峰面积作为纵坐标(Y)，进行标准曲线的绘制，并计算回归方程和线性范围等，结果如表4，表明苯甲酸、异鼠李素、芹菜素、金松双黄酮、异银杏素的对照品溶液在各自浓度范围里有良好的线性关系，(S/N>10)。

表4 5种对照品的标准曲线

2.3.5 精密度的考察 把混合对照品溶液②在上述色谱条件进样6次，记录5种对照品的峰面积，分别计算它们的保留时间和峰面积的RSD值。结果苯甲酸、异鼠李素、芹菜素、金松双黄酮和异银杏素保留时间的RSD值分别为0.11%、0.31%、0.19%、0.13%、0.18%；峰面积的RSD值分别为0.67%、0.87%、0.60%、0.42%、0.74%。从结果可以看出仪器的精密度良好。

2.3.6 稳定性的考察 称取同一批次的黔产香榧假种皮粉末，按“2.2.1”项方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下，分别在0、4、8、12、16、20、24 h进样，记录5个对照品的峰面积，分别计算它们的保留时间和峰面积的RSD值。结果苯甲酸、异鼠李素、芹菜素、金松双黄酮和异银杏素保留时间的RSD值分别为0.12%、0.07%、0.15%、0.11%、0.08%；峰面积的RSD值分别为2.44%、2.93%、2.33%、2.49%、2.58%，可见香榧假种皮供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.7 重复性的考察 称取6份同一批次的黔产香榧假种皮粉末，按上述方法制备供试品溶液，在色谱条件下进样，分别计算各色谱峰的保留时间和峰面积的RSD值。结果苯甲酸、异鼠李素、芹菜素、金松双黄酮、异银杏素保留时间的RSD值分别为0.09%、0.11%、0.09%、0.06%、0.08%；含量的RSD值分别为3.49%、1.87%、1.88%、1.82%、3.24%，从结果可以看出该方法的重复性良好。

2.3.8 加样回收率的试验 称取9份已知含量的黔产香榧假种皮粉末，每份为0.5 g，依次按照80%、100%、120%的比例分别精密加入对应体积的5种单一对照品溶液，按上述方法制备供试品溶液，在色谱条件下进样，记录每种成分的峰面积，计算加样回收率。加样回收率=(实测质量-样品所含被测成分的质量)/加入对照品质量×100%。结果见表5，苯甲酸、异鼠李素、芹菜素、金松双黄酮和异银杏素的平均回收率在96.98%～101.08%，符合95%～105%的范围、RSD≤1.57%，符合要求，可知该方法的加样回收率良好。

表5 黔产香榧假种皮中5种化学成分加样回收率的结果

续表

2.3.9 18批黔产香榧假种皮样品中5种成分的含量测定结果 取18批黔产香榧假种皮样品，依照上述方法制备供试品溶液，按色谱条件逐个进样，分别将苯甲酸、异鼠李素、芹菜素、金松双黄酮和异银杏素的峰面积代入线性回归方程，计算其含量，结果见表6。其中，苯甲酸、异鼠李素、芹菜素、金松双黄酮和异银杏素含量最高的分别为S8(贵州省遵义市务川县石朝乡浪水村)、S18(贵州省遵义市务川县石朝乡沙坂村)、S6(贵州省遵义市务川县石朝乡浪水村)、S17(贵州省遵义市务川县石朝乡沙坂村)和S17，该5种化学成分总含量最高的为S18(贵州省遵义市务川县石朝乡沙坂村)。

表6 18批香榧假种皮中五类成分含量

2.3.10 聚类分析 采用Simca-P 14.1软件，将共有峰的峰面积作为变量，进行系统聚类分析，结果如图7。18批香榧假种皮样品被分为2类：Ⅰ类包括S16～S18号样品，均在贵州省遵义市沙坂村采集；Ⅱ类包括S1～S15号样品，此类样品均在贵州省遵义市大漆村、浪水村、京竹村和高峰村采集。Ⅰ类和Ⅱ类样品表明不同村子之间的样品存在一定差异。

图7 2 类样品聚类分析结果

3 讨论

3.1 方法的建立

3.1.1 HPLC色谱柱以及流动相的考察 本研究考察的色谱柱类型有：Agilent Eclipse Plus C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)和Agilent Eclipse XDB C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，实验结果显示，Agilent Eclipse Plus C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)的柱效更优。并且考察了不同流动相体系：水-甲醇、水-乙腈、醋酸水-甲醇和醋酸水-乙腈等，结果显示，采用0.06%醋酸水-甲醇流动相的体系时，色谱峰保留时间更佳，特征峰的分离度符合范围，色谱图的基线较平稳，色谱峰有较好的对称性。

3.1.2 检测波长的选择 采用HPLC-DAD对各对照品以及香榧假种皮供试品溶液进行全波长扫描，苯甲酸、异鼠李素、芹菜素、金松双黄酮和异银杏素的紫外最大吸收波长分别在230 nm、255 nm与370 nm、270 nm与340 nm、270 nm与330 nm、270 nm与330 nm。结合香榧假种皮供试品溶液各个波长的色谱图分析，最终分别以230 nm作为苯甲酸的检测波长，以255 nm作为异鼠李素的检测波长，以270 nm作为芹菜素、金松双黄酮的检测波长，以330 nm作为异银杏素的检测波长。

3.1.3 香榧假种皮样品处理方法的考察 保持其他条件不变的前提下，本实验考察了40%、70%、100%甲醇提取香榧假种皮，根据5个对照品对应峰的峰形和峰面积选择最优提取溶剂百分比。再以100%乙醇同法操作，测定结果与100%甲醇比较，结果显示以100%甲醇作为提取溶剂时，香榧假种皮供试品溶液的峰形较好，5个对照品对应的峰总面积最大。

保持其他条件不变的前提下，实验考察了超声30、60、90 min后的香榧假种皮提取情况。发现提取90 min时，香榧假种皮中5个对照品对应的峰总面积仅略微高于提取60 min时的峰总面积，从节能减排方面考虑，选择提取60 min。

保持其他条件不变的前提下，实验中分别考察了以超声、冷浸、水浴回流60 min后对香榧假种皮的提取情况。发现超声提取时香榧假种皮的5个对照品峰总面积最大。因此，本研究选择超声方法提取香榧假种皮。

保持其他条件不变的前提下，实验中考察了料液比1∶10、1∶15、1∶20时的香榧假种皮提取情况。发现料液比1∶15时香榧假种皮的5个对照品总含量最高，因此选择料液比1∶15。

香榧假种皮样品处理方法最终筛选结果为：以100%甲醇提取香榧假种皮，料液比为1∶15，超声60 min。

3.2 香榧假种皮质量分析 本实验的18批香榧假种皮样品采自贵州省遵义市务川县石朝乡的5个不同村子，样品批次多，具有一定的代表性。测定结果表明，18批不同村子香榧假种皮指纹图谱与对照指纹图谱相似度为0.995～1.000，相似度均较高，表明引种后，贵州省遵义市务川县石朝乡样品之间的指纹图谱具有较好的一致性。18批香榧假种皮的苯甲酸、异鼠李素、芹菜素、金松双黄酮和异银杏素含量分别为(56.49～110.91、183.14～418.64、69.81～104.91、105.59～197.17、270.36～400.22)μg/g，5种成分总含量平均值为884.85 μg/g，总含量最高的为沙坂村的S18(1127.14 μg/g)，总含量最低的为浪水村的S5(754.71 μg/g)，采自沙坂村的S16～S18总含量排在前三位。说明不同村子香榧假种皮5种成分含量有所差异，差异原因有待进一步研究，有望为黔产香榧栽培提供理论指导。

综上所述，本研究首次建立了黔产香榧假种皮的指纹图谱；首次建立同时测定香榧假种皮中的苯甲酸、异鼠李素、芹菜素、金松双黄酮和异银杏素5种化学成分含量的HPLC分析方法，为黔产香榧假种皮资源的进一步开发利用提供科学依据，更多具有药理活性的化学成分有待后续进一步研究。