先天性心脏病遗传学研究进展

汪希珂 综述 田颖 审校

(贵州省人民医院儿科心血管病区，贵州 贵阳 550002)

先天性心脏病(CHD，简称先心病)是胚胎时期心血管发育异常所致的心脏形态、结构和功能的异常。它是一类危害婴幼儿生命健康的常见先天畸形，占婴幼儿出生缺陷的首位，其发病率为活产婴儿的6-8‰，死亡率在新生儿非感染性死亡中占首位约10‰[1]。先心病的病因尚不清楚，研究认为，遗传和环境因素共同参与了先心病的发生。研究[2-3]发现，先心病存在家族聚集现象，家族成员患病危险度高于普通人群，并且与血缘关系远近相关，血缘关系越近，患病率越高。因此，对先心病遗传学发病机制的研究是目前国内外研究者聚焦的一大热点。随着人类基因组计划的完成、分子生物学和遗传学技术的发展，先心病分子遗传学研究取得了一定的共识。研究认为先心病分子遗传学机制复杂：单基因突变，多基因突变，染色体变异，基因组拷贝数变异都有可能导致心脏畸形的发生[4-5]。

1 基因突变与先天性心脏病

通过动物模型的胚胎期心脏发育学研究发现心脏畸形的发生与基因突变相关。进一步研究发现基因突变既可导致孤立型先心病，也可导致综合征型先心病。目前，基因突变与先心病的研究主要通过对家系进行连锁分析和对大量无直接亲缘关系的个体或小家系进行连锁不平衡分析两种，通过从基因数据库中找到与先心病发生相关的位点基因，然后检测候选基因的突变位点，从而最终发现致病基因。近年来，通过先心病家系的研究定位了一些与心脏发育相关的致病基因，包括TBX5，NKX2.5，GATA4，ZIC3，MYH6，NOTCH1，CRELD1，FOG2，等[6-7]。通过在散发先心病患者中进行相关基因的突变筛查发现NKX2.5和GATA4基因突变可导致房(室)间隔缺损和房室传导阻滞[8-9]。CRELD1突变导致孤立型(非综合征)房室间隔缺损[13-14]，ZIC3突变导致伴有内脏反位的复杂性先心病[10]，GATA-4突变导致房间隔缺损、室间隔缺损、法洛四联症等[11-12]，GATA-6突变导致永存动脉干、法洛四联症等圆锥动脉干畸形等[13-14]。截止目前，研究发现20多种致病基因突变导致散发或家族性孤立型先心病，而综合征型先心病中发现的致病基因是孤立型先心病的两倍多[5，15]。

虽然研究报道了越来越多参与调控心脏发育的基因突变与人类先心病发生相关，但对某个或某些基因突变是否引起先心病仍不能作出解释。因为在散发先心病例中难以发现同样的基因突变，即使在同一家系的不同成员中也可发生不同种类的心脏畸形。因此，其遗传方式仍不明确，提示多基因参与调控的遗传方式与环境相互作用的可能。

2 染色体异常与先天性心脏病

染色体异常主要包括非整倍体和微小缺失，是各种临床综合征最常见的病因。研究发现， 30%的染色体异常伴有心脏结构畸形[16]。通过染色体G 显带核型分析，可以检测出大部分染色体非整倍体异常：如Down氏综合征(21-三体综合征)，18-三体综合征，13-三体综合征等。其中，约 50% 的Down氏综合征伴发心脏间隔缺损，包括房间隔缺损，室间隔缺损和房室间隔缺损，80%的13-三体综合征伴发内脏反位和心脏缺损；几乎所有的18-三体综合征都伴发以间隔缺损为主的先心病[17-18]。传统染色体G 显带核型分析分辨率在5Mb 左右已在临床诊疗工作中筛查出包括心脏畸形在内的各种综合征，随着细胞遗传学技术的发展，分辨率更高的技术将用来分析染色体异常。

荧光原位杂交技术(FISH)是细胞遗传学和分子遗传学相结合的一种诊断技术。它是在原位杂交的基础上，利用荧光染料标记特异寡聚核苷酸片段作为探针，与待检测染色体DNA分子进行杂交，主要用于对染色体的定位。FISH技术的应用，大大提高了对染色体缺失和重复染色体异常的检测灵敏度。其中，染色体缺失最典型的两个病例是威廉姆斯综合征和22qll.2微缺失综合征。威廉姆斯综合征是常染色体显性遗传疾病，主要表现为典型的面部特征，特殊心血管畸形，高钙血症，神经发育异常及骨路、肾脏发育畸形。心血管畸形主要为主动脉瓣上狭窄，肺动脉狭窄和外周肺动脉狭窄，约90%以上具有典型临床表现的威廉姆斯综合征患者可通过FISH检测出来，其主要致病原因是染色体7qll.23区域基因的微缺失[19]。进一步研究发现7qll.23区域基因不同程度的缺失所导致的威廉姆斯综合征临床症状的严重程度也不尽相同，进一步研究在此区域发现了导致该类综合征心血管发育异常的基因即弹性蛋白基因(Elastin)，该基因突变可导致主动脉或肺动脉的发育异常，同时，在散发主动脉瓣上狭窄患儿中也同样发现该基因突变[20]。22qll.2缺失综合征是一类由于染色体22qll.2发生微缺失而导致的疾病，包括DiGeorge综合征，锥干面综合征和腭心面综合征，这类综合征具有相同的遗传基础。包括典型的面容，腭裂，胸腺发育不全，心脏畸形及不同程度的认知、交流和发育障碍等。并发心脏畸形主要为法洛四联症，肺动脉闭锁/室间隔缺损，永存动脉干，主动脉弓中断等圆锥动脉干畸形[21]。

由于FISH 技术受探针特异性的限制，只能使用已知位点探针检测已知的染色体异常，不能用于发现新的染色体异常，限制了其进一步应用。多重连接探针扩增技术(MLPA)是一种针对待检DNA序列进行定性和半定量分析的技术，由Schouten等在2002年首先报道[22]。该技术也应用于人类基因片段的重复和缺失，MLPA能够一次性对已知基因的所有外显子进行缺失和重复的筛查，在临床诊疗中，遗传性疾病、肿瘤、出生缺陷和先心病都得到广泛的应用[23-24]。但是，MLPA仅对已知的突变位点或区域的检测，因此，需要有更为先进的技术进行染色体异常的检测。

3 拷贝数变异与先天性心脏病

3.1拷贝数变异概念和发生机制 拷贝数变异(CNV)是由基因组发生重排而导致，它是指与参照基因组比较，长度为1 kb 以上的基因组大片段的缺失、插入、重复、倒位和复杂多位点的变异，主要表现为亚显微水平的缺失和重复[25-26]。CNV广泛存在于人类和其他哺乳动物的基因组中，是遗传差异的重要起源。CNV 的形成依赖于重组和复制为基础的机制，CNV 产生的机制主要有非等位基因同源重组(NAHR)，非同源末端连接(NHEJ)。CNV通过各种分子机制，包括基因剂量、基因断裂、基因融合、位置效应等，导致了孟德尔遗传规律性疾病，散在疾病或与其他复杂疾病的发生[27-28]。

3.2拷贝数变异检测方法 目前，大多数CNV的研究是通过以下基因分析平台来实现：微阵列比较基因组杂交技术(Array-CGH)、微阵列单核苷酸芯片技术(SNP-Array)和新一代测序技术。比较基因组杂交技术(CGH)是在FISH的基础之上建立起来的，它是将目标待测基因组与正常对照基因组用两种不同的荧光染料标记，按照相应的比例混合后与正常人染色体杂交，用荧光显微镜观察荧光强度，通过计算正常组和目标组的荧光比率确定目标基因组的DNA拷贝数的增减。

微阵列比较基因组技术(Array-CGH)由传统CGH衍生，它将芯片技术利用在目标DNA基因组检测上，将DNA克隆或者cDNA做成微阵列代替传统CGH中的杂交靶，其分辨率较传统CGH高出100倍以上，通过定位拷贝数变异精确的位置从而确定目标基因。目前，用于Array-CGH检测的芯片探针主要是PCR扩增的BAC(细菌人工染色体)克隆和cDNA分子，较常用的是BAC克隆芯片，探针精度从最初的1Mb发展到目前应用的25bp。而SNP-Array芯片技术是在Array-CGH基础之上利用新的遗传标志—单核苷酸多态作为芯片发展而来的，通过比较目标基因DNA片段的信号强度与其他个体的强度，从而确定每个位点相对应的基因拷贝数目。SNP-Array与Array-CGH相比最大的区别是，SNP-Array芯片技术只需要目标基因组DNA片段与探针进行单杂交，而Array-CGH需同时对目标基因组DNA片段和参考基因组进行杂交。

同时，PCR技术是检测目标基因组区域是否存在拷贝数变异的基本技术，实时定量PCR(real time qPCR)能很好的对拷贝数缺失和重复进行定量检测，其准确率高。但是， qPCR 通常只能对一个区域进行检测，近年来，应用的短荧光片段多重 PCR(QMPSF)、多重扩增探针杂交(MAPH)和多重连接探针扩增 (MLPA)等技术可同时检测多达50个独立区域，并且可以检测传统方法所不能检测的所有外显子缺失和重复。

此外，新一代测序技术和相应的实验策略，如Paired-end mapping(PEM)与基于测序技术的深度检测分析方法也可以发现CNV并对其进行精确定位[27，29-30]。但目前由于该技术因成本和可靠性等问题还商未解决，故未得以广泛开展。但是，这一分析策略方法将是今后高通量CNV 分析方法的发展方向。

3.3拷贝数变异与先天性心脏病的研究 随着基因芯片技术的发展，研究者对先心病相关致病基因及作用机制有了越来越多的发现和认识。由于先心病种类繁多，致病基因众多，各种类型先心病与相关基因之间的联系和通路机制尚不清楚，并且CNV在先心病中的研究非常有限。2007年，Thienpont等应用Array-CGH技术检测了60例伴有心外畸形的综合征型先心病患者，发现18例患者拷贝数变异，其患病率为30%；同时，在CNV缺失区域验证了过去研究发现与先心病发生相关的致病基因NKX2.5，NOTCH1，NSD1 和EHMT[31]。Breckpot等研究报道了150例综合征型先心病患者中43例发生CNV，其中26个CNV被确定为致病性CNV[5]，该研究组报道了综合征性先心病CNV比与非综合征型先心病CNV高，其比值是19%：3.6%。Richards 等对20 例染色体核型正常的综合征型 CHD 患者的研究中发现5名患者存在致病性CNV[32]。Erdogan等对105例孤立型先心病应用BAC技术分析CNV，结果发现18个致病性CNV[33]。Greenway等对114例孤立性法洛四联症患者进行全基因组拷贝数分析研究发现11个新的CNV，对非综合征孤立性TOF发现CNV在1q21.1，3p25.1，7p21.3 和 22q11.2等区域，基于上述结果的发现，该研究认为至少有10%的CNV是孤立性TOF的发生的病因[34]。另外，Fakhro等对262名内脏异位伴心脏畸形的患者及991名正常人进行了CNV研究，结果在内脏反位患者中发现了罕见CNV的增加，在这些CNV的独特区域，研究者使用基因敲除方法在青蛙和非洲爪蟾进行了进一步的研究，结果定位NEK2，ROCK2，TCGBR2，GALNT11，和NUP188等5个基因在打乱了生物体左向右发展模式，最终导致内脏反位和心脏畸形[35]。Long Fei等对圆锥动脉干畸形家系进行CNV检测发现8p23.1缺失，进一步研究发现在其8p23.1附近区域的SOX7基因重复，推测位于8号染色体的SOX7基因可能是在先心病发生的致病基因[36]。通过对基因组拷贝数变异在人类先心病中的研究，将有望寻找出新的致病基因，为易感基因的定位、克隆及基因表达的研究提供一定的理论基础，可进一步揭示先心病的发病机制。

4 展 望

先心病遗传机制异常复杂，目前的研究已证实单基因突变、多基因突变、染色体变异以及近几年基于芯片技术的CNV均可能导致先心病的发生，提示遗传因素是先心病重要发病机制。随着CNV在先心病中的研究和新的发现，将促进对先心发病机制的认识和了解，同时，随着将来更加先进和准确的基因检测技术的出现，将有可能发现未知致病基因，这将进一步加深对先心病分子遗传学机制的认识，为将来先心病的早期分子诊断、遗传咨询和治疗开辟一条新的途径。