罗应坤 综述 张霓霓 黄桂林 审校

(遵义医科大学附属口腔医院,贵州 遵义 563006)

1 简 介

脱细胞组织被广泛应用于临床组织修复和再生。一些组织如皮肤、小肠黏膜下层、膀胱，以及来源于人、猪和牛的心包膜，已经可进行脱细胞化并制成商用支架[1]。同时，在基础研究和临床前研究中表明，还有大量的其他组织和器官已经经过脱细胞化，并应用于再生医学的各个方面[2]。脱细胞化后遗留下的细胞外基质(ECM)，作为组织的结构支撑以及细胞内的生物化学和生物物理信号的来源发挥着关键作用。ECM通过这两个角色指导细胞增殖、迁移、分化和行为[3]。每种组织的ECM为驻留细胞提供独特的组织特异性微环境。这种干细胞龛已适应自然，为细胞提供了其发挥功能所需的结构和生化信号[4]。因此推测脱细胞组织材料对该组织来源的细胞分化应有明显的影响。利用天然的干细胞龛引导细胞向特定的细胞谱系分化已经成为研究组织工程的热门途径。通过更加深入地了解脱细胞组织对细胞分化的影响，可以为细胞命运的控制和再生治疗的发展提供一个更有用的平台。本文将回顾制备脱细胞组织材料的不同方法和这些材料对细胞行为影响的研究，重点回顾细胞分化。这些材料可以是整个器官支架，ECM的切片或块，水凝胶及涂层，且现已从以下组织中成功制备：肺，肝，肾及涎腺。

2 制备去细胞化组织材料的方法

2.1脱细胞方法 组织脱细胞化的目标是保留ECM中所有的结构和生化信号，并去除在宿主中引起不良炎症反应和阻碍组织再生的细胞成分[2]。现有的组织脱细胞方案有机械、化学、酶解或去垢剂等不同方法[2,3]，在对上述方案进行了全面的比较后，还未找到对于每种组织均适用的最佳方案[2,5,6]。在选择脱细胞化方案时，重要的是要认识到一种方法并不适用于所有的组织，因为不同的组织在ECM密度、细胞密度和基本形态都上是不同的[2]。简单地说，冻融会影响ECM的超微结构，压力技术可能会影响ECM纤维的机械性能，碱性和酸性的溶液会降解ECM成分，离子去垢剂则会破坏蛋白质之间的非共价键，且后期难以从基质中清除，酒精也被证明在ECM交联胶原蛋白增加其刚度[1、2、6-8]。所有这些因素也会影响细胞与材料的相互作用，因为它们改变了细胞直接接触的环境。因此，必须谨慎地为每种组织选择理想的脱细胞方法，因为它会影响细胞向特定谱系分化的成功[9]。简而言之，必须在设计和选择最佳的脱细胞方案时仔细考虑，才可最终将组织材料进行加工。

2.2材料准备 虽然脱细胞的组织材料可以作为完整的器官保留下来，但也可以对它们进行进一步加工，比如：切割成小片或小块，或溶解成液体制成水凝胶或基质涂层。每种组织都可以被加工成为不同类型的材料，并有不同的好处。当目标是设计一个可移植器官时，在去细胞化过程中保持整个器官的完整是很重要的。去细胞化器官维持着器官的宏观和微观结构以及自然的ECM组成，从而为器官的再细胞化和再生提供了平台[1]。

如果不需要一个完整的器官进行研究，那么可以使用脱细胞的器官薄片作为一种更方便的方法来测试ECM对细胞的影响，因为其仍然保持组织的结构和生化组成。制作这种切片主要有两种方法，一是先将整个器官去细胞，然后将其切成薄片；二是将未加工的器官切成薄片，然后再将切片脱细胞。片切脱细胞后的器官，必须先将其埋入琼脂糖、OCT冷冻介质或石蜡中使其变硬[9-12]。然而，制作脱细胞化切片最常见的方法还是先将组织切成所需的厚度，然后再将切片脱细胞化。该方法已用于肌腱、脑、肾、肺、肝、角膜基质和真皮[21-26]。脱细胞材料也可以制成介于完整器官和器官薄片之间大小，例如骨组织的4×4×3 mm立方体[30]或筋膜组织的4×2×0.5 cm切片[31]。

脱细胞组织也可以进一步加工成水凝胶。水凝胶通常用于向损伤部位注射以促进组织再生，但它同时也是细胞培养的有利平台，因为它们可以被大量制造，并且比ECM切片更容易存留细胞。制备方法根据实验目的和需要修改的特性有很大的不同。这些方法包括使用脱细胞基质作为水凝胶的唯一成分、使用交联剂，或者加用其他材料合成复合材料以进一步调节其性能。用胃蛋白酶对ECM进行冻干、碾磨和消化是一种将ECM作为水凝胶中唯一成分的常见方法。随后将ECM置于常温环境中形成水凝胶[26,32-36]。这些材料可单独用于体内[32-35]或在体外创建2D及3D培养环境[36]。

ECM材料的最后一类是基质涂层。首先通过类似于制造水凝胶的消化过程，制作一种以ECM作为原料的液体，然后将ECM蛋白吸附到组织培养器材表面。细胞随后被播种到涂层板或孔中，并与特定的生化信号相互作用。涂层类似于薄的脱细胞组织切片，其创建了一个2D平面来进行研究，但是却不再维持组织的固有结构。

3 ECM对细胞分化的影响

每种组织都有其独特的ECM组合物，并且以各种方式影响细胞分化。除了组织的结构，生化信号也在细胞命运决定中起着重要作用。现已经完成了多种实验来研究这种与不同组织、细胞类型和条件的相互作用。

3.1肺 许多研究表明，脱细胞肺基质能够促进更成熟的细胞类型(如祖细胞)向肺特异性细胞分化，而其他更原始的细胞类型则需要额外的信号才能开始向肺特异性细胞分化。Cortiella等人将小鼠胚胎干细胞(mESCs)接种到小块的脱细胞大鼠肺基质上，并使用肺细胞培养基培养。然而，与对照组相比，肺ECM的孔隙度和刚度的差异，不足以得出差异是由于ECM本身，而不是材料的机械和传输性能的变化所引起的结论。在灌注生物反应器中观察到，使用小气道上皮生长培养基在全脱细胞大鼠肺中培养人源间充质干细胞(hMSCs)，肺上皮细胞标记物增加[13]。之前的研究中使用了补充剂来达到最后的结果。进一步的研究也表明，肺ECM需要添加培养基补充剂来诱导MSCs的向肺特异性细胞分化，而不能只使用常规生长培养基[10]。

3.2肝脏 多项实验已证明，肝ECM能够引导细胞向肝细胞分化或维持肝细胞表型。初步研究确定，在两层脱细胞猪肝水凝胶间播种的人原代肝细胞，在观察白蛋白分泌、转运能力和氨代谢等功能特性时，其肝细胞表型与在基质凝胶上培养时一样成功[18]。随后的一项研究将人胎儿肝细胞和人胎儿卫星细胞在完全脱细胞的猪肝脏中灌注了13 d，并根据表型和基因分析显示细胞有完全成熟为上皮细胞的趋势[19]。

3.3肾脏 目前已应用脱细胞肾组织完成了多项实验，用细胞灌注全脱细胞肾脏显示了其在组织工程中应用的良好前景。当使用mESCs接种于一个完整的脱细胞大鼠肾脏时，在基质中内层血管细胞上可见上皮分化[20]。其表明肾基质对细胞分化有区域特异性作用。J.P.O′Neil等[35]人通过从猪肾脏的髓质、乳头和皮质中直接制取ECM切片、水凝胶和培养基补充剂来检测肾脏不同区域的区别，他们发现小鼠肾脏干细胞在每个肾脏区域具有不同的代谢活性、增殖和形态学差异。虽然分化不是直接测量的，但差异显示，不同的机械或生化信号也可能对干细胞分化产生区域特异性影响。值得注意的是，这些研究中没有一项直接得出结论说肾脏引起了肾特异性细胞的分化。另一项比较恒河猴肾脏和肺基质切片对hESCs的影响的研究表明，这两种物质都引起了肺和肾标志物的增加，且两者之间没有显着差异[22]。有学者[21]做了一项独特的实验，证明了脱细胞肾基质可以用于骨工程，因为保留完整的脉管系统为成骨细胞提供营养。在这项研究中，他们使用成骨介质将一个完整的脱细胞大鼠肾脏灌注入人类原代成骨细胞，并观察到成骨细胞保持其表型并重建了肾基质。这些结果表明，人们对肾ECM干细胞龛及其如何影响分化仍知之甚少。

3.4涎腺 学者[27]通过去垢剂对大鼠颌下腺进行脱细胞，随后将大鼠原代MSG细胞接种于其中，组织学染色及电镜观察显示脱细胞颌下腺基质有助于细胞粘附，免疫荧光染色进一步证实了人工合成的颌下腺在体外显示出了细胞分化的标记物。在另一项研究中，学者[28]将人涎腺上皮细胞(SGECs)在猪脱细胞肠基质上分别以2D和3D两种形式进行单独培养及同微血管内皮细胞共培养，免疫荧光及扫描电镜的结果证实了在3D培养下，SGECs生长良好并形成了导管状结构，并且表达α-amylase，CL-1以及AQP-5，而2D培养下的SGECs仅有α-amylase阳性表达，且3D培养中的α-amylase相关基因表达也明显高于2D培养。最新的成果显示，接种于大鼠涎腺脱细胞基质水凝胶上的大鼠涎腺干/祖细胞，经过水凝胶3D培养后，相较于平面培养，其α-amylase在蛋白水平的酶活性提升了高达14倍，然而对成熟导管干/祖细胞标志物表达有所下降，包括c-Kit，c-Met以及CD44。此外，细胞的基本上皮紧密连接标记物，例如CL-1，CL-3，Keratin 5，Keratin 18及E-cad在转录水平的表达经过在水凝胶内培养后恢复到了未经处理的涎腺水平[29]。这些研究都表明涎腺脱细胞基质能促进涎腺干/祖细胞向功能性涎腺细胞的分化。

4 目前存在的问题

以上研究针对每种组织类型都研究了一些同样的问题，这些问题为每种组织自身提出了一系列继续向前发展的挑战。常见的实验方法是探索脱细胞ECM的生化和机械信号在干细胞分化中的作用。这些研究为这些信号的效果提供了极为重要的洞见，但其成果往往局限于我们所能够研究的机械和生化信号组合数量。ECM本身是极为复杂的机械生化信号组合，因此很难确定究竟是哪些特定的成分或组合导致某些细胞行为。此外，大多数在包含材料刚度的研究都局限于2D培养基，而非可能与生理学联系更加紧密的3D培养基。

另一个常见问题是，分化是否存在组织或区域特异性影响。这些结果根据所比较的组织类型而不同。区域特异性在复杂器官内对分化的特殊影响，为所有脱细胞组织研究提供了一个有趣的假想，例如肾脏。即使不考虑区域特异性的研究，在创建样本时也必须保持谨慎，因为可能存在潜在的区域成分差异，因此对分化的影响也不同。

根据所回顾的几项研究，其他加工方法对ECM的影响也很重要。这为研究ECM效应提出了额外的挑战，因为材料本身可以改变实验结果。因此，继续致力于改进其处理方法是很重要的，但是在比较结果时也要保持处理方法的一致性。此外，还需要对ECM进行更多的定量分析，如基于质谱分析的QconCat技术，以更严格地评估ECM的差异和处理后脱细胞的效率。

最后一个在许多组织类型中反复出现的主题是病变脱细胞ECM对材料诱导分化能力的影响。这不仅对理解疾病机制很重要，而且对提升脱细胞ECM材料的生产力也很重要。许多可用作脱细胞材料的人体样本要么已经老化，要么已经患病。为了确保制作的ECM材料的一致性，必须彻底了解可能影响材料质量的因素(包括捐赠者的健康状况和年龄)。

5 结 论

脱细胞组织材料在许多不同的应用中都取得了成功。目前这些材料的设计包括完整的器官基质、切片、块、水凝胶和涂层。为了保持原有的结构，并结合所有有利于细胞分化的线索，还需进一步扩展用于创建脱细胞ECM的材料和方法[1-3]。每种组织在进行脱细胞和处理材料时都有自身的障碍，随着新的组织用于脱细胞实验，将会有新的挑战需要克服。每种不同的材料类别对于特定的应用也有独特的优点，完整器官基质可用于移植和器官替换；水凝胶最适合创建三维环境，可用于注射治疗；切片和涂层有助于直接发现基质成分对细胞分化的影响。

总的来说，脱细胞材料对细胞分化有明显的影响。迄今为止，肺、肝、肾、涎腺、及其他脱细胞组织在实验室环境中显示出对细胞分化有积极影响的迹象。然而，每种组织能引导细胞谱系分化的能力不同。肝脏组织表现出单独使用ECM直接引导细胞分化的能力，且无需添加其他补充剂。其他组织对干细胞行为有影响，但需要额外的信号来控制干细胞朝组织特定谱系分化。这可能是由于独特的组织微结构、脱细胞过程中改变的ECM结构及成分，或其他未知因素。因此必须进行进一步的研究，以便更充分地了解这些细节。

在设计脱细胞组织材料时，了解组织和材料类型之间的差异是极其重要的。尽管人们普遍认为ECM包含指导组织特异性基因表达的必要线索，但引导细胞分化需要许多因素，仅靠ECM可能不足以满足所有组织工程目的。然而，现有的研究文章表明，脱细胞组织材料可以利用自然界自身的天然组分，成为一种强大的工具。随着未来的研究和发展，该领域具有良好的潜力，为基础和转化组织工程研究提供强大的支持。