王立斌 赵青 杨珊珊 刘亭 杨畅△
(1.贵州医科大学/省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室&贵州省药物制剂重点实验室,贵州 贵阳 550004;2.贵州医科大学/民族药与中药开发应用教育部工程研究中心,贵州 贵阳 550004;3.贵州医科大学药学院,贵州 贵阳 550025)
脑卒中具有高发病率、高死亡率和高致残率的特点，在全球每年新增患者约1 500万，其中缺血性脑卒中占脑卒中发病率80%[1]，其特点是流向大脑的血流减少、脑组织的病理改变、局灶性精神功能缺失等，涉及一系列复杂的反应机制，包括氧化应激、兴奋性中毒、炎症等[2]。灯盏花属菊科植物短葶飞莲Erigeronbreviscapus(Vant.) Hand.-Mazz.的干燥全草，临床上主要用于治疗心绞痛、中风、改善认知障碍等[3-4]。其灯盏花素是灯盏花中的黄酮类成分[5]，具有清除自由基、改善微循环、抑制血管平滑肌细胞增殖等作用[6]。在2015版药典中，关于灯盏花素制剂的质量规定，灯盏花素片剂里灯盏乙素(Scutellarin,Scu)的含量不能低于90%，灯盏花素注射液里灯盏乙素的含量不得低于98%[7]。提示灯盏乙素是制剂中发挥药效的主要成分，且有动物实验[8]表明灯盏乙素对脑缺血的治疗效果优于灯盏花素。因此本文以中药有效单体灯盏乙素为研究对象，通过神经功能缺损评分，TTC染色法测定脑梗死面积，HE染色观察大脑海马区的病理状况及，TUNEL检测测定大脑的凋亡细胞等药理学研究方法，对灯盏乙素的脑保护作用进行研究，以期为临床用药和药物研发提供实验依据。
1 材料与方法
1.1实验动物 SD成年雄性大鼠，体重(260±10)g，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK(湘)2014-0011，适应性喂养7 d，环境温度在(25±3)℃，相对湿度在(50±10)%的动物房。
1.2材料与仪器 动物饲料(江苏协同医药生物有限责任公司)；MCAO栓线(型号：2636-A4，北京西浓科技有限公司)；灯盏乙素(纯度>98 %，昆明涞医药科技有限公司)；TCC(Sigma-aldrich公司)；水合氯醛(天津大茂化学试剂厂)；生理盐水(贵州科伦药业有限公司)；10 %甲醛(重庆江川化工有限公司)；无水乙醇(成都海兴化工试剂厂)；二甲苯(福晨(天津)化学试剂有限公司)；盐酸(成都市科龙化工试剂厂)；重铬酸钾(天津致远化学试剂有限公司)；浓缩型二苯基联苯胺(DAB)试剂盒(北京中杉金桥生物有限公司)；胰蛋白酶K(美国Merck Millipore公司)；苏木素染液(武汉赛维尔生物技术有限公司)；伊红染液(武汉赛维尔生物技术有限公司)；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)。EL240十万分之一电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；THZ-82A水浴恒温振荡器(上海皓庄仪器有限公司)；转轮式切片机(徕卡-2016，德国)；TSJ-Ⅱ型全自动封闭式组织脱水机(常州中威电子仪器有限公司)；BMJ-Ⅲ型包埋机(常州中威电子仪器厂)；PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪(常州中威电子仪器有限公司)；数码三目摄像显微镜(BA400Digital，麦克奥迪实业集团有限公司)；图像分析软件Image-Pro Plus 6.0(美国Media Cybernetics公司)；Pannoramic 250型全景数字幻灯片扫描(3DHISTECH公司)。
1.3实验方法
1.3.1分组 60只SD(Sprague Dawley)大鼠随机分为正常组、MCAO模型对照组、低、中、高剂量组(2、5、10 mg·kg-1)，其中每组12只大鼠，6只作为TCC染色，6只作为HE染色和TUNEL荧光染色。(本实验造模过程中死亡大鼠，造模后未存活到3 d的大鼠，评分为0和4的大鼠，将补充对应数量合格模型完成实验。)大鼠脑缺血1 h后尾静脉注射给药，并于24 h和48 h再次给药，正常组和模型对照组注射为生理盐水。
1.3.2建立动物MCAO模型 术前禁食12 h，自由饮水，腹腔注射10 %水合氯醛(3.5 g·kg-1)麻醉，将麻醉好的大鼠以仰卧位固定，颈部用75%酒精消毒，沿颈部中线开口，钝性分离筋膜，在颈部右侧观察到颈总动脉，呈“Y”字型，结扎颈总动脉近心端和颈外动脉，暂时关闭颈内动脉，在颈总动脉上剪开一个小口，将栓线插入颈内动脉，并将栓线上黑色标记处过于颈总动脉三岔处，用缝合线固定栓线，缝合伤口。栓线插入1 h后，将栓线拔出颈内动脉，对其进行再灌注。24 h后进行评分，评分在1～3分为MCAO模型成功，排除死亡和不符合标准的模型。
1.3.3神经功能缺损评分 再灌注24 h后进行评分，神经行为评分中，避免对动物不必要的干扰，所有大鼠均被温和地对待，避免强硬动作对大鼠造成额外的创伤及对实验结果的影响。 采用Zea-longa5分制法，评分标准:0分：无明显的神经损伤症状；1分：前爪不能完全伸展；2分：行走时向对侧侧转圈；3分：行走时向对侧倾倒；4分：不能自发行走，无自主意识。
1.3.4TTC染色 大鼠股动脉放血后处死后，迅速将大鼠放在冰袋上断头取脑，于-20℃环境条件下冷冻固定脑组织20 min，取出将全脑冠状面切成5片；用磷酸缓冲液配制1 %TCC染料浸泡脑组织并摇床孵育、避光染色15 min，最后用10%甲醛固定后拍照。将照片导入Image J软件计算脑梗死面积。按以下公式进行计算：脑梗死面积=白色区域面积/整个脑的总面积×100%。
1.3.5HE染色 用中性10%甲醛固定大鼠脑组织，经脱水、修剪、包埋、切片、染色、封片后，镜检每张切片先于40倍下观察全部组织，了解大体病变后，选择观察的区域采集400倍的图片，观察具体病变。
1.3.6TUNEL检测 用中性10%甲醛固定大鼠脑组织，按TUNEL试剂盒检测说明书上操作处理，甘油封片，荧光显微镜检测每张切片先于100倍下观察全部组织，再根据组织大小采集3张200倍图像，计算分析凋亡细胞的数量。
2 结 果
2.1MCAO模型24 h时Zea-longa5评分结果 正常组评分为(0±0.00)，模型组评分为(1.75±0.62)，低剂量组评分为(1.92±0.51)，中剂量组评分为(1.83±0.39)，高剂量组评分为(2.00±0.60)。模型组与给药组之间无统计学差异(P>0.05)，MCAO模型组与正常组有显着性差异(P<0.001)。见图1。
图1 各组大鼠24 h后的神经功能损伤评分
2.2脑缺血再灌注第3天的TTC染色结果 经TCC染色，正常脑组织部位染色显红色，脑梗死部位显白色，通过Image J软件测得脑梗死面积百分比，正常组为(0±0.00)%，模型对照组为(26.8±6.00)%，低剂量组为(25.81±2.80)%，中剂量为(22.90±1.84)%，高剂量组为(17.33±1.75)%。从图2A染色结果可以观察出，MCAO模型组与正常组有显着性差异(P<0.001)；与对照组相比，给药组脑切片中白色面积部分均变小，低、中、高剂量均有改善脑缺血的作用，且高剂量和中剂量组与模型对照组相比均有显着性差异(P<0.05)，呈现高剂量梗死面积减少最大，中剂量次之，低剂量稍有减少。
注：A.大鼠的TTC染色切片；B.大鼠的脑梗死面积百分比。图2 TTC染色结果
2.3大鼠脑缺血再灌注第3天脑部HE染色结果 正常组海马CA1区域胞核胞质分界不清(黑色箭头)，未见明显炎症；模型对照组海马CA1区域呈现锥体细胞层排列较为紊乱，细胞散在分布明显，锥体细胞不同程度变性坏死，可见细胞肿胀，胞质染色不均或呈空网状，胞核固缩，染色加深或核溶解消失；低剂量海马CA1区域组呈现锥体细胞坏死、锥体细胞周围轴突变性，局部锥体细胞轻度变性坏死，见部分坏死细胞胞质空泡化、胞核溶解，部分细胞胞核固缩；中剂量组海马CA1区域呈现锥体细胞层数量轻微或轻度减少，见少数细胞散在分布；未见明显胶质细胞增生或炎细胞浸润；高剂量组海马CA1区域呈现锥体细胞层少量细胞排列较为紊乱，但可见排列趋势。模型对照组与给药组相比，给药组低、中、高剂量组病变程度均有所减轻，其中中剂量组病变好转最优，高剂量组次之，低剂量组有轻微好转。见图3。
图3 各组大鼠海马CA1区的HE染色结果(×400)
2.4再灌注第3天TUNEL脑细胞凋亡结果 经TUNEL染色，凋亡细胞呈红色，正常细胞呈蓝色。通过全景数字幻灯片扫描软件测得细胞凋亡结果，正常组细胞凋亡百分率为(0±0)%，模型对照组为(54±4)%，低剂量组为(31±3)%，中剂量组为(23±1)%，高剂量组为(13±3)%。正常组与模型组相比，基本无细胞凋亡，给药组与模型对照组相比，低剂量组、中剂量组和高剂量组的细胞凋亡率有显着性地降低(P<0.01)。见图4。
注：A.TUNEL染色结果(×200)；B.大鼠脑组织细胞的凋亡率。图4 TUNEL脑细胞凋亡结果
3 讨 论
灯盏花素在临床上被广泛用于心脑血管疾病[8-9]。有研究[10]证明，灯盏乙素对脑缺血的保护作用优于灯盏花素，且有更好的量效关系。因此本实验建立大鼠脑缺血再灌注模型，选取神经功能缺损评分、脑梗死面积，脑部病理变化及神经细胞凋亡结果作为药效评价指标，拟从系统、器官、细胞水平上，综合分析灯盏乙素对大鼠脑缺血再灌注的保护作用。
神经功能缺损评分反映了大鼠MCAO模型在整体表观上的受损程度。在给药第1天时，对所有大鼠进行Zea-Longa 5分法评分，发现各给药组的神经功能均有一定程度改善，但与模型组相比没有显着性差异，可能是脑缺血本身产生的复杂损伤机制，如：自由基反应、兴奋性毒性氨基酸、PARP酶的激活等作用引起的脑损伤较大[11]，也可能是给药剂量不足或者给药时间过短，还未显效造成的。TTC是一种将正常脑组织染色成红色，脑梗死部位染色成白色或苍白色的染料。通过Image J软件可将脑梗死组织量化为面积，直观地反映灯盏乙素在脑组织层面的治疗作用。结果显示，随着灯盏乙素剂量的增加，脑梗死面积逐渐降低，且与模型对照组相比，具有显着性差异，因此说明灯盏乙素具有一定的脑保护作用。HE染色结果同样观察到灯盏乙素能有效改善脑缺血对海马的损伤，减少神经细胞排列紊乱、数量减少和细胞肿胀的现象，但高剂量组的细胞肿胀程度高于中剂量组且观察到给药高剂量组的大鼠在药物治疗期间，出现过激的行为较多，猜测可能是由于高剂量的灯盏乙素诱导产生兴奋性毒性氨基酸(谷氨酸、γ-氨基丁酸、甘氨酸等)对大鼠行为的影响；而大鼠在过激后表现出的抑郁行为，可能是由于抑制性氨基酸对神经系统起保护作用[12-13]。TUNEL测定脑凋亡细胞，同样发现随着灯盏乙素剂量的增加，脑凋亡细胞减少。
本实验证实灯盏乙素具有一定的脑保护作用，且药效呈剂量依耐性。但灯盏乙素半衰期短，体内代谢快[14]，要在临床上广泛使用，还需科研工作者对其进行结构改造、优化或赋予其适当剂型，以提高药物在体内的生物利用度、延长药物在血液里循环的时间。
