夏凤琼 王明栋
(1.贵州省骨科医院检验科,贵州 贵阳 550004;2.贵阳市公共卫生救治中心检验科,贵州 贵阳 550003)
21世纪工业化迎来前所未有的发展,但环境污染及食品污染问题却严重威胁着人们的健康,导致生育能力逐年下降。不孕不育这个问题因此慢慢进入大众视野,引发全球关注。在过去的40年里,全球范围内的男性精液质量逐年下降,导致越来越多的育龄夫妇不能够自然生育[1],而超过半数的原因来自于男方[2],中国育龄男性精液质量和生育能力呈现出下降趋势[3]。2008年的“三鹿奶粉事件”[4-5]让三聚氰胺进入公众视野,掀起世界乳制品的巨大波澜。由此,专家学者对三聚氰胺这种含氮杂环有机化合物进行了一系列的研究。研究发现,三聚氰胺具有吸入毒性、较低的急性皮肤毒性、眼睛刺激及皮肤刺激[6-8],对肾脏也有一定的毒性作用[9],对鸡[10]、鸭[11]、鱼[12]、猪[13]的肝脏有一定的毒性作用,甚至能引起中枢神经系统中海马神经元的凋亡[14]。也有研究[15]显示,动物长期暴露于三聚氰胺会导致胚胎毒性,还可引起小鼠精子DNA损伤[16]。但是,有关三聚氰胺的雄性小鼠睾丸生精细胞的能量代谢及氧化应激方面的研究还较少。因此本研究以健康雄性昆明种小鼠为研究对象,用不同剂量的三聚氰胺通过灌胃对小鼠进行染毒,以睾丸组织酶活性及氧化应激的检测来探讨三聚氰胺对雄性小鼠能量代谢及氧化应激的影响。
1 材料与方法
1.1实验动物 选择6～8周龄及体重25～30 g的健康雄性昆明种小鼠50只。实验动物均购自于第三军医大学大坪医院野战外科研究所医学实验动物中心(许可证号SCXK(渝)2001-0005)。
1.2药品和主要试剂 三聚氰胺购自美国Sigma 公司,环磷酰胺购自江苏恒瑞医药股份有限公司,山梨醇脱氢酶(Sorbitol dehydrogenase,SDH)试剂盒及乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)试剂盒购自美国R&D公司,考马斯亮蓝测定试剂盒、超氧化物歧化酶(Superoxide Dimutese,SOD)及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
1.3分组及染毒方法 将雄性小鼠随机分为五组,每组10只,即阴性对照组(生理盐水),阳性对照组(环磷酰胺),三聚氰胺低、中、高剂量组。低、中、高剂量组分别按照400 mg/kg、800 mg/kg 、1 600 mg/kg 体重每天定时经口灌胃三聚氰胺混悬液1次,阴性对照组按照0.1 mL/10 g体重每天经口灌胃生理盐水1次,阳性对照组按照40 mg/kg体重每天腹腔注射环磷酰胺1次,各实验组均连续给药5 d。染毒期间小鼠自由饮食饮水。
1.4标本采集方法 颈椎脱臼处死小鼠后立即剪开腹腔,取出双侧睾丸置于-80℃保存用于检测睾丸组织酶活性。
1.5ELISA法检测小鼠睾丸匀浆LDH 、SDH的活性 取-80℃保存的睾丸在冰面上剥离被膜,准确称量,按质量(g)∶体积(mL)比为1∶9滴加生理盐水进行组织匀浆,制成10%的匀浆液,4℃下高速离心(10 000 prm,离心10 min),取上清。按照LDH及SDH试剂盒说明书进行测定。
1.6睾丸组织匀浆中蛋白质含量、SOD及MDA含量的测定 取一定量的10%睾丸组织匀浆,用生理盐水按1∶9稀释成1%的组织匀浆,按说明书进行测定睾丸匀浆中蛋白质浓度、SOD活性及MDA的含量。
2 结 果
2.1三聚氰胺对小鼠睾丸匀浆LDH、SDH活性的影响 随着染毒剂量的增加,SDH的活性下降,与阴性对照组相比,各剂量组差异均显着(P<0.05/P<0.01);LDH的活性也下降,与阴性对照组相比,高剂量组差异显着(P<0.05)。各剂量组SDH、LDH检测结果与阳性对照组相比差异均不显着(P>0.05)。见表1。
表1 三聚氰胺对各实验组小鼠睾丸组织LDH、SDH活性的影响
2.2三聚氰胺对小鼠睾丸组织SOD活性及MDA含量的影响 各染毒组SOD活性下降,与阴性对照组相比,差异均显着;与阳性对照组相比,差异均不显着(P>0.05)。三聚氰胺各实验组MDA含量有升高趋势,但差异不显着(P>0.05)。见表2。
表2 三聚氰胺对各实验组小鼠睾丸组织SOD活性、MDA含量的影响
3 讨 论
环磷酰胺(cyclophosphamide,CP)是目前常用的一种烷化剂类抗肿瘤药物,临床常用于各种自身免疫性疾病、恶性肿瘤的化疗及类风湿关节炎的治疗,与此同时,CP也可对男性生精功能造成损害[17]。因此,本研究以环磷酰胺作为阳性对照,与阴性对照组比较,三聚氰胺各剂量组睾丸组织抗氧化能力及能量代谢酶活性均降低,与杨群芳的报到一致[17],表明本研究所建立的动物模型是成功的。
精子在发生和成熟过程中需要足够的能量供应。SDH、LDH在维持睾丸组织结构的稳定中发挥重要作用。SDH可以将山梨醇转化为果糖,在精子的糖代谢中很重要;LDH是参与糖酵解的重要酶,催化丙酮酸转化为乳酸,是参与生精细胞糖代谢的主要酶类[18]。本次实验中,SDH、LDH的活性均降低,提示三聚氰胺可能引起小鼠睾丸生精细胞能量生成不足,阻碍能量供给,最终可能会导致小鼠生殖能力的下降。SDH、LDH活性降低原因可能有:三聚氰胺直接作用于睾丸组织;产生脂质过氧化作用引起细胞膜损伤,能量代谢酶从胞内流出,导致其活性下降;也可能是三聚氰胺引发肾损害导致厌食引起小鼠产能不足[19]。
氧化应激在许多外源性化学物质的毒性作用机制中扮演着十分重要的角色。当机体的氧化—抗氧化平衡被打破时便会产生氧化应激。SOD是氧自由基的清除剂,是体内最主要的抗氧化酶之一[20],在维持自由基代谢平衡中起重要作用。如果SOD活性降低,体内过多的自由基积累将影响精子的生成,引起小鼠生殖能力的下降。MDA对细胞具有严重的损伤作用,是自由基与不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的主要代谢产物,常被用来间接反应机体自由基代谢的变化及脂质过氧化的标志[21]。本次研究中,三聚氰胺各剂量组及阳性对照组SOD活力相比阴性对照组均降低显着,且三聚氰胺各剂量组的SOD活力与阳性对照组相比差异无显着性。说明三聚氰胺可能引起小鼠睾丸的抗氧化能力的降低,干扰小鼠睾丸的氧化─抗氧化系统的平衡。本研究中,各实验组之间MDA含量差异无统计学意义,并且阳性对照组也未出现相应变化,可能原因有试剂盒保存温度不当或者检测方法的局限性。
综上所述,三聚氰胺对雄性小鼠有一定的生殖毒性作用。本研究所用剂量的三聚氰胺使雄性小鼠睾丸组织能量代谢酶的活性降低,抗氧化能力下降,干扰小鼠睾丸组织能量代谢过程及氧化─抗氧化系统的平衡。
