张 娟,陈海燕

(赣南医学院基础医学院，江西 赣州 341000)

黑色素瘤是临床上常见的皮肤恶性肿瘤，且发病率呈逐年增加的趋势，每年新发病例约2万人。该病恶性程度高，易发生转移至肝脏和脑部。其死亡率占皮肤恶性肿瘤第一位，5年生存率不足5%，因此黑色素瘤已成为严重危机人们健康的疾病之一[1-2]。目前黑色素瘤的治疗主要是外科手术、化疗和放射治疗，虽然能够大面积清除肿瘤细胞，但是也会不可避免损伤正常细胞，导致机体出现不良反应，免疫功能下降等，因此，近年来国内外对天然抗癌成分的研究越来越活跃。

Lampronti 等[3]研究了夏季香薄荷、冬季香薄荷、鼠尾草、薰衣草、百里香、小茴香和野薄荷中的精油能抑制人体白血病细胞中的K562 细胞系的生长；Patil 等[4]报道了从莱蒙中提取的精油能抑制人结肠癌细胞的增殖；Yoon 等[5]报道日本柳杉精油能增强免疫功能，迷迭香精油能抑制不同结构的化学致癌物质在动物细胞中的致癌性等[6]。柑橘类精油是通过植物萃取或蒸馏得到的精油，具有清甜的香味。国外学者Matsuura等对13种柑橘属植物精油进行了体外实验，发现柑橘类精油对络氨酸酶活性有一定抑制作用，进一步成分分析发现，柠檬烯和月桂烯属于亲脂性化合物，更易通过人体皮肤生物膜，从而更快有效地发挥美白功效[2]。柠檬烯也是橙皮精油的主要成分，本实验就是采用特有的赣南脐橙的皮渣提取精油，分别作用于体外培养B16小鼠黑色素瘤细胞和3D胶滴模型培养的其分化和增殖更接近实体瘤的黑色素瘤细胞，分别从急性和慢性角度研究精油对黑色素瘤细胞增殖的抑制作用，为黑色素瘤临床治疗提供研究基础[7]。

1 材料与方法

1.1材料和设备RPMI-1640(购自Solarbio公司)、ExCell澳洲胎牛血清、小鼠皮肤黑色素瘤细胞B16-F10 细胞(购于无锡菩禾医药技术有限公司)、3D试剂盒(南昌乐悠生物技术有限公司)、橙皮精油(江西恒诚天然香料油有限公司)、噻唑蓝(MTT)(Sigma 公司)、二甲基亚砜(DMSO)(Solarbio公司)。

细胞培养箱(Panasonic MCO-18AC)、超净工作台、光学显微镜、低速离心机、酶标检测仪、 摇床。

1.2实验方法

1.2.1B16黑色素瘤细胞培养在无菌条件下，将B16黑色素瘤细胞接种于含10%澳洲胎牛血清的RPMI-1640培养基中，与二氧化碳培养箱中37 ℃、5%CO2饱和湿度环境中培养，每天换液。当细胞生长至汇合度为80%～90%时，经0.25%胰蛋白酶消化传代，继续培养。每次实验取自同一传代细胞，初始接种细胞浓度为1×105个·mL-1，接种于96孔培养板，每孔100 μL，37 ℃，5%CO2培养箱内培养24 h，待细胞开始贴壁增殖，添加4个浓度梯度的橙皮精油，留一个不加药物的对照组。

1.2.2细胞形态观察取指数生长期的B16黑色素瘤细胞，经消化分散制备单细胞悬液，调整细胞密度，以每孔1×104个的细胞密度接种于96孔板，培养12 h待细胞完全贴壁后更换新培养基，每孔加入100 μL不同浓度受试物，每个浓度设置6个复孔，对照组加入新鲜培养液，培养48 h后置于显微镜下观察对照组和实验组的细胞大小、形态、生长密度、树突形态及融合状态等，并拍照记录。

1.2.3MTT比色法检测细胞增殖率细胞悬浮液前处理同上，铺板时每孔加人100 μL不同浓度受试物，每个浓度设置6复孔，对照组加入新鲜培养液，培养24 h后每孔加入1 mg·mL-1MTT溶液10 mL, 37 ℃，5%CO2培养箱内培养避光孵育3～4 h，弃去培养基和MTT，向各孔加入200 μL的DMSO，以溶解残留的MTT，室温于摇床震荡10 min。震荡混匀后用酶标仪测定各孔在492 nm波长下测定吸光值。细胞增殖率按以下公式计算：细胞增殖率=(实验孔OD-空白孔OD)/(对照组OD-空白孔OD)×100%。

1.2.4B16小鼠黑色素瘤细胞胶滴的制备

1.2.4.1消化B16细胞调整细胞浓度至1.5×105个·mL-1，取760 μL细胞悬液，在冰浴盒中冰浴；用100 μL枪头在0 ℃的0.01 M pH7.4 PBS或生理盐水中吹打几次预冷，吸取23 μL试剂一加入上述细胞悬液中，混匀；100 μL枪头在0 ℃的0.01 M pH7.4 PBS或生理盐水中吹打几次预冷，吸取12 μL试剂二加入上述混合液中，立即吹打4～5次混匀；提前将100 μL枪调至40 μL的量程，用1 000 μL枪头在0 ℃的0.01 M pH7.4 PBS或生理盐水中吹打几次预冷，吸取200 μL试剂三于上述混合液中，立即吹打4～5次混匀。

将已提前调好的40 μL量程的100 μL的枪在0 ℃的0.01 M pH7.4 PBS或生理盐水中吹打几次预冷，吸取40 μL上述混合液种胶滴，40 μL为一个胶滴，六孔板的每个孔可种3～4个胶滴。

小心将种好胶滴的六孔板放入37 ℃,5%CO2中孵育凝结30 min左右，倾斜六孔板胶滴不会立即流动即可，将六孔板放入超净工作台内小心轻缓加入2～4 mL培养基培养。

1.2.4.2胶滴细胞给药培养孵箱中培养24 h后在培养基中加入浓度梯度为0、0.02%、0.04%、0.08%、0.16%、0.32%橙皮精油。药物作用24 h后，弃去板内培养液，加入新鲜培养基继续培养8天，此时板内细胞已增殖明显。

1.2.4.3胶滴中细胞的染色固定小心吸去板内培养基，注意不要吸去板内胶滴，加入2 mL生理盐水，加入10 μL 1 %的中性红溶液，使其终浓度为50 μg·mL-1，左右轻轻晃动培养板使中性红染液与生理盐水混合均匀，将培养板置于培养箱中染色2 h。弃去板内溶液，加入适量4%中性甲醛(覆盖住胶滴即可)固定45 min。用双蒸水漂洗胶滴10 min，打开盖子室温晾干后保存。

1.2.4.4显微镜下观察染色状态，并拍照记录。

1.2.5Transwell侵袭实验将基底胶加到transwell的上室中，37 ℃孵育transwell 板3～4 h后，水化基底膜，用枪头轻轻吸出板内剩余液体，用无血清培养基轻洗凝胶一遍。取细胞悬液100 μL加入Transwell小室，在下室中加入含10%血清的1640完全培养基，按照细胞侵袭能力培养12～24 h，本次实验取18 h、20 h、24 h三个时间点。

1.2.6细胞划痕实验用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀地划竖线，大约每隔0.5～1 cm一道，竖穿过孔，每孔画3条线。消化B16黑色素瘤细胞接种到6孔板内，待细胞长满至95%以上，将100 μL垂直于六孔板，用直尺对照着贴合背后的竖线划痕，用PBS轻洗细胞2次，去除划下的细胞。每孔分别加入含橙皮精油浓度为0、0.02%、0.04%、0.08%、0.16%、0.32%的无血清培养基，放入37 ℃ 5%CO2培养箱培养。取3 h、6 h、9 h、11 h、22 h、30 h 6个时间点观察处理。

2 结 果

2.1MTT测定橙皮精油对B16黑色素瘤细胞的抑制作用

2.1.1不同浓度精油对细胞形态的作用传代的B16黑色素瘤细胞主要为两极，从图1可见，对照组细胞生长良好，形态正常；当加入不同浓度的精油后，细胞形态均出现不同程度的变化： 0.625%精油组的细胞形态变化不明显，数量有所减少；1.25%精油组的细胞树突减少或消失，细胞数量明显减少；2.50%和5.0%精油组的细胞数量明显减少，细胞不能融合形成网状结构。

图1 不同浓度精油对 B16黑色素瘤细胞形态影响(×100)

2.1.2橙皮精油对细胞增殖率的影响各浓度精油组黑色素瘤细胞的抑制率均显着高于对照组(t=94.346、283.852、210.809、350.887、164.017，P<0.05)，且0.625%、1.25%、2.5%、5%精油组的抑制率明显高于0.31%精油组(t=-8.885、-10.692、-11.904、-10.572，P<0.05)，差异均有统计学意义(P<0.05)。而其他两组两两比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，说明当精油浓度在1.25%～5%之间时，精油对细胞的抑制作用达到一定极限，见图2。

图2 不同浓度橙皮精油对B16黑色素瘤细胞抑制率的影响

2.2基于B16小鼠黑色瘤细胞的胶滴三维模型的细胞实验

2.2.1B16小鼠黑色素瘤细胞三维培养模型的建立据前述的方法， B16小鼠黑色素瘤细胞胶滴在6孔板培养基中可稳定存在，胶滴对其内部的B16小鼠黑色素瘤细胞有生长支持作用，在培养到第8天时，可见胶滴内部细胞呈团状生长(见图3对照组)。由此可确定B16小鼠黑色素瘤细胞三维培养模型构建成功。

2.2.2精油对三维培养的B16小鼠黑色素瘤细胞的影响经染色、固定、洗涤后，肉眼可见5种不同浓度橙皮精油作用于风干的胶滴后，呈现深浅不一的染色状态，且随着精油浓度的增加，染色深度逐渐减小。显微镜下观察示细胞被中性红染料染成红色，细胞越多红色越深。对照组B16小鼠黑色素瘤细胞在3D环境下增殖旺盛，而不同浓度精油组中的B16细胞数随着精油浓度的增加而逐渐减少，至橙皮精油浓度为0.32%时基本没有增殖的细胞。见图3。

图3 B16黑色素瘤细胞胶滴中染色的细胞团(×400)

2.3Transwell实验检测橙皮精油对B16黑色素瘤细胞侵袭能力的影响细胞加入transwell小室后，小室的下室加入含10%FBS的培养基，由于营养物质的趋化作用，能够使细胞由上室往下室迁移。从结果可以看出，经过不同浓度的橙皮精油刺激后，黑色素瘤细胞向基底膜侵袭能力发生改变。随着橙皮精油浓度的增加，细胞侵袭至下室的细胞数减少，在18 h拍照时，0.16%和0.32%组的细胞侵袭基底膜数目基本一致，与MTT实验结果一致。见图4。

图4 向transwell下室迁移的B16黑色素瘤细胞(0.1%结晶紫染色,×100)

2.4划痕实验检测橙皮精油对B16黑色素瘤细胞迁移能力的影响由图5可以看出，随着时间的增加划痕的长度逐渐减少，且随橙皮精油浓度增加，划痕长度减少的速度越来越慢。由Pearson相关性检验可知，划痕长度与精油的浓度呈正相关性(r=0.345,P<0.05)。说明随橙皮精油浓度的增加，细胞的侵袭能力逐渐减弱。

图5 不同浓度精油对黑色素瘤细胞迁移能力的影响

3 讨 论

黑色素瘤是人类皮肤中发生的一种高度恶性肿瘤，具有易转移、预后差等生物学特性。白色人种是黑色素瘤的高发人群，我国虽属黑色素瘤的低发国家，但近年来其发病率呈明显上升趋势，据统计，我国每年约有2万新发病例，对患者的生命健康造成严重危害[8]。黑色素细胞中含有黑色素小体，黑色素小体中含有酪氨酸酶，受外界因素影响，酪氨酸酶能够活化并且催化血液中的酪氨酸继而生成黑灰色的多巴醌，进而聚合成黑色素颗粒[9]。整个过程受黑色素细胞形态及各种酶的影响[10]。因此，通过抑制黑色素瘤细胞的增殖是治疗的根本。

本研究发现，橙皮精油对小鼠黑色素细胞瘤有较好的抑制作用。澳胎牛血清培养的小鼠黑色素瘤细胞，随着精油浓度的增加，细胞数目明显减少，细胞形态变化也较大，但当精油浓度超过5%时，MTT实验结果并没有相应地反映出这一结果，分析原因可能是由于实验过程中浓度高的精油在孔板内会结成透明的硬壳物质，铺在细胞上方，用PBS洗并未能除去，从而影响细胞与MTT的充分接触，导致结果有所偏差。

三维培养的细胞一般呈团状或球状生长，其分化和增殖方式更接近于实体瘤[11-12]。因此，构建一个稳定的三维细胞培养模型，进行体外药敏研究，研究结果会更加符合体内环境，中性红是一种常用的染色试剂，能被活细胞摄取而着色，死亡细胞无法摄取[13]。本实验结果可以看出，肉眼观察到不同浓度精油组染色处理后的B16黑色素瘤细胞，呈现深浅不一的染色状态，且随着精油浓度的增加，染色深度逐渐减小。由此可以推断，精油可以透过胶滴对其内部的黑色素瘤细胞产生抑制作用，精油浓度为0.16%时，其内部存活的细胞数较少，相比前面组别肉眼所见的中性红染色较浅，精油浓度达0.32%时，基本无中性红染色。进一步证实了橙皮精油对小鼠黑色素瘤细胞增殖的抑制作用，为临床治疗提供一定的研究基础。

癌细胞的侵袭和迁移是肿瘤患者临床致死的主要原因。在划痕实验和transwell迁移试验中，对黑色素瘤细胞给予橙皮精油刺激后，细胞迁移能力减慢，精油浓度越高，细胞体外迁移能力越弱，由此可知，橙皮精油在一定程度上可以抑制黑色素瘤细胞的转移和侵袭。 陈皮精油主要成分是单萜烯类，相对含量占92%之多[14]，其中主要成分是柠檬烯，具有较强的生理活性，路小光、王玲、宋宝珠都有报道柠檬烯能抑制胃癌细胞浸润、转移及凋亡[15-17]；Jayaprakasha G K, Jia S S等研究表明柠檬烯对结肠癌细胞有抑制作用[18-19]；曲明阳、栾鹏等报道其对乳腺癌也有一定的抑制效果，能够下调Fascin蛋白的表达[20-21]，是否对黑色素瘤的抑制作用起作用，还有待进一步研究。

综上所述， 本实验只是初探橙皮精油对体外B16黑色素瘤细胞的抑制作用， 没有直接对小鼠造模进行研究，并未对橙皮精油中的各成分生物活性进行研究，真正对B16黑色素瘤细胞起作用的成分未知晓，这些都是今后研究的重点。