赣南地区非小细胞肺癌EGFR突变和ALK重排的临床研究

钟炜祥，韦晰凤

（1.赣南医学院第一附属医院胸外科，江西 赣州 341000；2.广西医科大学第一临床医学院，广西 南宁 530001；3.赣州市妇幼保健院，江西 赣州 341000）

表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor，EGFR）突变和间变型淋巴瘤激酶（Anaplastic lymphoma kinase，ALK）基因重排是非小细胞肺癌（Non-small-cell lung cancer，NSCLC）靶向治疗中最重要的两个驱动靶点，研究［1-2］发现，表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）、间变型淋巴瘤激酶-络氨酸激酶抑制剂（ALK-TKIs）等小分子靶向药物治疗给NSCLC患者带来显着的临床获益。

文献［3-5］报道，NSCLC患者中EGFR突变和ALK重排存在一定的地域差异。黄刚等［6］采用real-time PCR法检测156例NSCLC病例，51例EGFR基因第19或21外显子突变，阳性率为32.7%；罗小宁等［7］针对68例晚期NSCLC病例，应用多种检测方法发现30例EGFR基因突变，阳性率为44.1%。

本研究在进一步扩大样本量的基础上通过对入组病例进行严格限定，仅探讨赣南地区原发性NSCLC病例中EGFR突变特点。同时，首次针对赣南地区原发性NSCLC病例进行ALK重排的研究。回顾性分析EGFR突变和ALK重排患者的临床病理特征，旨在阐明赣南地区原发性NSCLC患者EGFR突变和ALK重排的临床特点，科学指导此类患者优选靶向药物。

1 对象与方法

1.1 一般资料选取赣南医学院第一附属医院2016年至2020年经病理检查确诊的原发性NSCLC病例332例，其中男212例，女120例；平均年龄（60.55±10.448）岁，中位年龄62岁（26~89岁）；无吸烟史177例，有吸烟史155例；按肺肿瘤分类2015（WHO）标准进行病理分型，腺癌254例；鳞癌73例；其他类型5例，包括腺鳞癌3例，黏液表皮样癌1例，未分型1例。临床分期按国际协会肺癌研究会第八版国际肺癌TNM分期标准执行，Ⅰ期54例，Ⅱ期35例，Ⅲ期57例，Ⅳ期186例。入组患者来自于赣南地区，均为初治，未接受过化疗、放疗、靶向治疗及免疫治疗。本研究经赣南医学院第一附属医院医学伦理委员会批准（NO.LLSC-2021081601/NO.LLSC-2021081602）。

1.2 方法

1.2.1 筛选病例外科手术切除组织标本90例（27.11%），CT引导下经皮肺穿刺活检组织标本169例（50.90%），电子支气管镜活检组织标本73例（21.99%），均为原发癌灶，共计332例。

1.2.2 标本固定由医院病理科进行石蜡包埋固定，按至少5μm厚度切取病理白片15张外送；另外32例CT引导下经皮肺穿刺活检新鲜组织标本离体后储存在RNAfixer组织保存液中固定后外送。经患者及家属知情同意并自行承担检测费用，332例样本先后外送至鼎晶医学检验所进行EGFR突变检测，其中297例同时进行ALK重排检测。

1.2.3 EGFR突变的检测

1.2.3.1 DNA提取采用QIAamp DNA FFPE提取试剂盒（QIAGEN）提取样本DNA，应用分光光度计检测DNA纯度和浓度。

1.2.3.2 EGFR突变检测采用ARMS-PNA（肽核酸）技术检测EGFR基因第18、19、20、21外显子突变，具体操作方法参照人类EGFR基因突变检测试剂盒（荧光PCR法）（海吉力，注册证书编号：3400973）说明进行。

1.2.4 ALK重排的检测

1.2.4.1 总RNA提取采用组织RNA抽提kit（Qiagen）试剂盒提取样本总RNA，利用紫外分光光度仪测定模板总RNA的浓度（＞30 ng·μL-1）和纯度（OD260/OD280值为1.8~2.0）。

1.2.4.2 逆转录（Reverse transcription，RT）合成cDNA参照M-MLV反转录试剂盒说明书设置RT程序：25℃5 min；42℃60 min；75℃5 min；4℃5 min。

1.2.4.3 Real-Time PCR体系RT产物通 过SYBR Green PCR master mix（Applied Biosystems）试剂进行PCR，反应体系中加入荧光物质并采用ABI7500 PCR仪（赛默飞世尔科技）检测。PCR程序参照人EML4-ALK融合基因检测试剂盒（Real Time PCR）使用说明书进行设置：⑴UNG酶反应：50℃2 min 1个循环；⑵预变性：95℃10 min 1个循环；⑶变性：95℃15 s；退火、延伸及检测荧光（荧光通道为FAM）60°C 32 s；共45个循环；⑷溶解曲线（60~95℃按1%的速度递增，此阶段吸收荧光信号）：95℃15 s 1个循环；60℃1 min 1个循环；95℃30 s 1个循环；60℃15 s 1个循环。引物序列：EML4-ALK-M（ALK-21/22F1：GCAA GTGGCTGTGAAGAC；ALK-22/23R1：GGTGGTTGAATTTGCTGATG），EML4-ALK-N（ALK-18F1：AAGGCCACGGGGAAGTG；ALK-18/19R1：GGGTGGGTGACACAATGC），GAPDH-Q（GAPDH-QF：GCCACATCGCTCAGACACC；GAPDHQR：GATGGCAACAATATCCACTTTACC）。

1.3 统计学方法本组资料为计数资料，以百分数表示。应用SPSS 24.0软件，采用χ2检验或确切概率法进行单因素分析，以二分类非条件Logistic回归方程进行多因素分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC中EGFR突变和ALK重排的检测EGFR突变146例，阳性率为43.98%（146/332），其 中19del突 变77例，L858R突 变54例，二 者 占89.73%；ALK重排23例，阳性率为7.74%（23/297）；EGFR突变和ALK重排共存突变6例，占2.02%。见图1、图2、图3和表1、表2。

图1 NSCLC 19del突变（WK无突变；IC内部对照）

表1 EGFR突变类型及比例

表2 EGFR和ALK基因共存突变患者的临床病理特征

图2 NSCLC NSCLC L858R突变（WK无突变；IC内

图3 NSCLC ALK突变（GAPDH：内参基因）

2.2 EGFR突变NSCLC患者的临床病理特征女性、不吸烟、肺腺癌患者EGFR突变率显着高于男性、吸烟、非肺腺癌患者（P均=0.000）；T1~T2期患者EGFR突变率明显高于T3~T4期患者（P=0.000）。EGFR突变与样本组织类型、患者年龄、临床分期（Ⅰ~Ⅱ和Ⅲ~Ⅳ）、有无淋巴结（N0和N1-3）和远处转移（M0和M1）等均无相关性（P＞0.05）。见表3。

表3 赣南地区NSCLC患者EGFR突变与各临床病理特征的单因素分析（总例数=332）

结合专业知识，纳入性别、年龄、吸烟史、组织样本、病理类型及T、N分期等构建多因素Logistic回归方程进行分析：相对于男性，女性增加EGFR突变发生的风险，差异有统计学意义（OR=2.547，95%CI1.281~5.061，P=0.008）；相对于非腺癌，腺癌增加EGFR突变发生的风险，差异有统计学意义（OR=5.512，95%CI2.538~11.969，P=0.000）；相 对 于T3~T4分期，T1~T2期增加EGFR突变发生的风险，差异有统计学意义（OR=1.805，95%CI1.046~3.112，P=0.034）。见表4。

表4 赣南地区NSCLC患者EGFR突变与相关临床病理特征的二分类Logistic回归分析

2.3 ALK重排NSCLC患者的临床病理特征女性、不吸烟且合并淋巴结转移（N1~3）患者ALK重排表达率显着高于男性、吸烟且无淋巴结转移（N0）患者（P均＜0.05）；新鲜组织样本中ALK重排表达率明显高于石蜡切片组织样本（P=0.034）；Ⅲ~Ⅳ期患者ALK重排表达率显着高于Ⅰ~Ⅱ期患者（P=0.037）。ALK重排与患者年龄、病理类型、T分期和M分期等均无相关性（P＞0.05）。见表5。

表5 赣南地区NSCLC患者ALK重排与各临床病理特征的单因素分析（总例数=297）

结合专业知识，纳入性别、年龄、吸烟史、组织样本、病理类型、临床分期及N、M分期等构建多因素Logistic回归方程进行分析：性别、年龄、吸烟史、组织样本、病理类型、临床分期及N、M分期等因素与ALK基因是否重排差异均无统计学意义（P均＞0.05）。见表6。

表6 赣南地区NSCLC患者ALK重排与相关临床病理特征的二分类Logistic回归分析

3 讨论

肺癌诊疗已迈入了精准医学时代，EGFR突变是肺癌分子靶向治疗中最主要的靶点，与目前广泛应用于临床的吉非替尼、厄洛替尼及奥希替尼等小分子EGFR-TKIs敏感性显着相关，在NSCLC的治疗中显示出很好的抗肿瘤疗效［8］。研究［9］证实，NSCLC中EGFR突变主要发生在第18~21外显子，其中第19外显子缺失突变（19del）和第21外显子点突变（L858R）是最常见的突变类型，占所有EGFR突变类型的85%~90%。本研究结果显示，赣南地区NSCLC中EGFR突变率为43.98%，与皖南［10］地区（43.18%，95/220）接近，高于重庆［11］地区（38.85%，359/924），低于辽宁沈阳［12］地区（53.7%，253/471）。其中，19del突变77例（占52.7%），L858R突变54例（约占37.0%），二者约占90%。目前，19del突变和L858R突变NSCLC被认为是两种不同的疾病，在EGFR突变晚期NSCLC患者中进行更精细地分型而治已经成为目前的共识。研究［13-15］发现，EGFR-TKI单药在19del突变晚期NSCLC人群中的疗效要优于L858R突变患者，达可替尼是中国L858R突变晚期NSCLC患者的更优选择。本研究入组病例均来自赣南地区十八县市区，客家人居多，且EGFR突变中19del突变相对多见，提示赣南地区NSCLC患者能从EGFR-TKIs靶向治疗中获益更大。

赣南地区女性、肺腺癌患者EGFR突变率显着高于男性、非腺癌患者（P＜0.05），佐证了EGFR-TKIs靶向治疗的获益人群多为女性、肺腺癌患者［16］；不吸烟NSCLC患者EGFR突变率显着高于吸烟患者（P=0.000），但Logistic多因素分析未发现二者之间的相关性（P＞0.05），可能是患者性别、年龄以及病理类型等混杂因素干扰的结果，抑或是基因-环境的交互作用所致；T1~T2期患者EGFR突变率明显高于T3~T4期患者（P=0.000），提示T＜5 cm的NSCLC患者EGFR突变率相对更高。此外，EGFR突变与组织样本类型（石蜡切片VS新鲜活检）、患者年龄、临床分期（Ⅰ~Ⅱ和Ⅲ~Ⅳ）、有无淋巴结（N0和N1~3）和远处转移（M0和M1）等均无相关性（P＞0.05）。

ALK重排是继EGFR之后第二受关注的靶点，针对ALK重排的靶向药物发展迅速，克唑替尼［17］、阿来替尼［18］、劳拉替尼［2］等ALK-TKIs的临床使用显着改善了ALK重排晚期NSCLC患者的生存，甚至超过了EGFR-TKIs的临床疗效。本研究结果显示，赣南地区NSCLC患者ALK重排的阳性率为7.44%（23/297），稍高于国内整体表达水平（即3%~7%）［19］）。单因素分析结果显示，赣南地区女性、不吸烟NSCLC患者ALK重排表达率明显高于男性、吸烟患者（P＜0.05），进一步表明ALK重排多见于不吸烟、女性肺癌患者，与相关研究结果一致［3，20-21］。探讨ALK重排的性别差异原因可能与雌激素相关，有研究［22］表明，雌激素受体表达增加可能与性别相关的NSCLC发生风险增加有关；有淋巴结转移（N1~3）患者ALK重排的表达率显着高于无淋巴结转移（N0）患者（P＜0.05），此与TIAN G等［23］的研究结论一致；外科手术大标本和新鲜活检组织是肺癌驱动基因检测的理想标本［24］，新鲜组织中ALK重排表达率（18.8%）明显高于石 蜡 组织（6.4%）（P=0.034），故首选新鲜组织标本进行ALK重排检测。然而，Logistic多因素分析表明，性别、年龄、吸烟史、组织样本、病理类型、临床分期及N、M分期等均不是发生ALK重排的风险因素（P值均＞0.05），提示ALK重排可能是NSCLC中相对独立的致癌因子。

此外，本研究发现6例EGFR突变和ALK重排共存突变病例，阳性率为2.02%（6/297），高于王鑫等［25］总结的结果，可能与地域、检测技术及肿瘤分期等因素相关。进一步回顾性分析发现，赣南地区EGFR突变和ALK重排共存突变多见于女性、不吸烟、合并骨转移的Ⅳ期肺腺癌患者，EGFR突变亚型以19del、21L858R等经典突变类型为主。

综上所述，赣南地区NSCLC患者EGFR突变和ALK重排的阳性率相对较高，EGFR突变好发于T＜5 cm、女性、腺癌患者，以19del突变亚型相对多见；ALK重排可能是NSCLC中相对独立的致癌因子。EGFR突变或ALK重排作为NSCLC患者EGFR-TKIs或ALK-TKIs治疗敏感性的预测因子，根据基因分型科学指导此类患者优选靶向用药，实现赣南地区NSCLC患者个体化精准治疗。