宫颈癌中Eag1钾离子通道的表达以及缺氧对其的调控作用*

林 爽,李 力,易 萍,郑秀惠,郭建新,韩 健

(第三军医大学大坪医院野战外科研究所妇产科,重庆 400042)

宫颈癌中Eag1钾离子通道的表达以及缺氧对其的调控作用*

林 爽,李 力△,易 萍,郑秀惠,郭建新,韩 健

(第三军医大学大坪医院野战外科研究所妇产科,重庆 400042)

目的研究不同病变宫颈组织中Eag1表达情况以及缺氧对宫颈癌Hela细胞膜上Eag1钾离子通道表达的影响。方法采用免疫组化、免疫荧光和RT-PCR法,检测不同病变宫颈组织和宫颈癌Hela细胞中Eag1蛋白的表达情况,以及不同缺氧时间和缺氧浓度对Hela细胞中Eag1 mRNA表达的影响。结果免疫组化结果表明,宫颈上皮内瘤变组织中Eag1蛋白的表达明显高于正常组,宫颈癌组织中Eag1的表达明显高于宫颈上皮内瘤变组;Eag1的表达随临床分期的增高而增加;与病理分级无明显相关性。免疫荧光、RT-PCR结果表明,正常培养的宫颈癌Hela细胞中即有Eag1表达;其表达随缺氧程度加深及缺氧时间的延长明显增强。结论Eag1钾离子通道蛋白有可能成为新的早期筛查和判断宫颈癌生物学行为的诊断指标。Eag1在宫颈癌Hela细胞缺氧感受中起重要的作用。

宫颈癌;钾离子通道;Eag1

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤,虽然目前诊疗技术有了较大的提高,但仍有30%～40%的患者死于局部复发和远处转移。最近有关离子通道与低氧适应之间的关系引起了越来越多的注意[1]。有研究认为膜Eag1钾离子通道宫颈癌的相关性最为密切[2]。但目前Eag1在宫颈癌组织中的表达情况仍需进一步证实。本研究以不同病变宫颈组织和体外培养的人宫颈癌Hela细胞为研究对象,通过研究Eag1钾离子通道在宫颈癌发生、发展过程中的表达情况以及缺氧对Eag1钾离子通道表达的影响,以期为宫颈癌的诊治提供新的途径。

1 资料与方法

1.1 一般资料 标本全部来自本院妇产科1995年12月至2008年12月诊治的病例,全部标本均经本院病理科诊断并证实。选取慢性宫颈炎20例,宫颈上皮内瘤变(CIN)40例(CINⅠ15例,CINⅡ10例,CINⅢ15例),宫颈鳞癌80例,共计140例。患者年龄24～77岁,平均 46岁。

1.2 细胞缺氧模型的准备 观察细胞70%～90%融合,细胞贴壁形态良好。在无菌条件下弃去大部分培养液,剩余培养基仅可将细胞覆盖,以减少气体弥散距离。将各组细胞同时置于密闭容器,将混合气体(含 90%N2、5%CO2、5%O2)以 10 L/min流量充入密闭容器,持续20 min,同时关闭进气口和出气口,抽取气体经血气分析仪检测容器内O2浓度小于5%。

1.3 Eag1表达的检测

1.3.1 免疫组化检测方法 兔抗人Eag1单克隆抗体购自sigma公司。组织标本常规石蜡包埋,制成4 μ m厚切片,常规脱蜡,30%新鲜双氧水灭活内源酶,将切片浸入0.01 M枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0),微波炉加热至沸后断电,间隔10 min重复2次,冷却后0.02 M PBS洗涤,抗原修复液修复抗原,山羊血清封闭后不洗,滴加1∶150稀释的Eag1单克隆抗体,4℃过夜,0.02 M PBS洗后加生物素标记羊抗兔二抗,30℃染色20 min后,DAB显色,苏木素轻度复染,二甲苯透明,封片。显微镜下观察并计数阳性染色细胞数。

1.3.2 免疫荧光检测方法 对数生长期的Hela细胞接种于装有载玻片的无菌培养皿中,95%乙醇室温固定30 min。加0.3%TritonX-100室温 10 min;PBS洗3次,每次10 min;正常山羊血清37℃封闭10 min,吸去不洗;加兔抗人单克隆抗体Eag1(1∶100),4℃孵育;PBS洗3次,每次10 min;加羊抗兔IgG-FITC(1∶100),37℃孵育2 h;PBS洗 3次,每次10 min;荧光显微镜观察照相。

1.3.3 判断标准 Eag1主要定位于胞浆和(或)胞膜。根据肿瘤细胞显色的比例及染色强度,对Eag1表达作半定量评定[3]。按阳性细胞率评分:阳性细胞数小于 11%为 1分;11%～50%为2分;51%～80%为3分;大于 80%为4分。按显色程度评分:染色弱为1分;中等染色为2分;强染色为3分。然后将2种评分结合起来分为4级:无论染色强度如何,细胞阳性率小于或等于10%为阴性;评2～3分者为弱阳性(+);评4～5分者为中度阳性(++);6～7分者为强阳性(+++)。若1例标本有2个染色结果,则取1个纳入统计。

1.4 RT-PCR法检测Eag1 mRNA表达 Trizon试剂盒购自Invitrogen公司,反转录试剂盒购自TaKaRa公司。Eag1引物为 :5′-TAA TGG CT T CCC TCT T TC ATC TCC T-3′;5′-TGT TGA GAC TCC TCC ATT CCT TCC A-3′(450 bp);βactin 引物为 :5′-CAC GGC TGC TTC CAG CTC CT-3′;5′-CTC CTG CT T GCT GAT CCA CAT C-3′(150 bp)。 取(0.5～1)×107细胞,按 Tripil试剂盒说明提取总 RNA,按反转录试剂盒说明进行逆转录反应,Eag1 mRNA的PCR反应条件为94℃变性30 s,58℃Eag1退火30 s,72℃2 min,最后72℃延伸2 min。琼脂糖电泳测定Eag1 mRNA表达,拍照。每一组检测6瓶细胞。

2 结 果

2.1 Eag1蛋白在不同宫颈病变中的表达

2.1.1 Eag1在慢性宫颈炎、CIN及宫颈鳞癌中的表达 Eag1在3种组织中均为细胞浆、胞膜表达,细胞核未见表达。Eag1在慢性宫颈炎及CIN中呈轻度着色,Eag1在宫颈鳞癌中呈中强度着色,阳性信号弥漫分布于癌巢内(插页Ⅰ图 1～3)。Eag1在宫颈鳞癌中的表达率明显高于慢性宫颈炎组和CIN组,CIN组内Eag1表达率明显高于慢性宫颈炎组,差异有统计学意义(P＜0.01),结果见表1。

2.1.2 Eag1在各级CIN中的表达 Eag1在C1N各级之中的表达随病变程度的增高逐渐增高,但各组比较无统计学意义(P＞0.05),见表 2。

表1 Eag1在慢性宫颈炎、CIN和宫颈癌组织中的表达

2.1.3 Eag1表达与宫颈癌临床病理学指标的关系 Eag1在不同病理分级中的阳性表达率虽然随病变恶性程度的增高逐渐增高,但各组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。在不同的临床期中,Ⅰ+Ⅱ期组 Eag1表达明显高于0期(P＜0.01),而Ⅲ+Ⅳ期组Eag1表达明显高于Ⅰ+Ⅱ期组和0期组,差异有统计学意义(P＜0.01),结果见表3。

表2 Eag1在各级CIN中的表达

表3 Eag1表达与宫颈癌临床分期、病理分级的关系

图5 不同缺氧条件下宫颈癌Hela细胞中Eag1 mRNA水平变化

2.2 Eag1蛋白在Hela细胞的表达 本科选择宫颈癌Hela细胞株,采用间接免疫荧光法检测细胞内Eag1蛋白的表达,结果发现Eag1蛋白主要集中在细胞膜上及胞浆中(插页Ⅰ图4)。

2.3 缺氧对Eag1 mRNA表达的影响 采用RT-PCR法检测了Eag1 mRNA在不同缺氧条件下宫颈癌Hela细胞系的表达情况,给予不同缺氧条件,3 h后Hela细胞中其mRNA的表达水平不尽相同,随缺氧程度的增加呈现先增高后降低的趋势(图5);在5%氧浓度条件下,其表达随缺氧时间的增加逐渐增高,见图 6。

图6 不同缺氧时间下宫颈癌Hela细胞中Eag1 mRNA水平变化

3 讨 论

宫颈癌是妇科三大恶性肿瘤之一。研究发现肿瘤内部乏氧不仅可引起肿瘤的发生、发展,还可引起肿瘤细胞放化疗抵抗,但其具体的缺氧调控机制仍不十分清楚。最近有关离子通道与低氧适应之间的关系引起了越来越多的注意[3-4]。离子通道中最常与细胞增殖和肿瘤相关的是钾通道;其中膜Eag1钾离子通道被认为与宫颈癌的相关性最为密切。

Eag1钾离子通道是1969年发现的一种新的通道,属电压门控性钾通道,通过去极化而激活。专一分布于大脑,在肌细胞和胎盘中有少量表达[5-6]。Eag表达和激活在多种肿瘤细胞株和重要的肿瘤组织中被证实。Fatias等[7]通过对6例宫颈癌组织标本和12例正常宫颈组织进行逆转录PCR和Southern印迹实验,发现6例宫颈癌标本Eag1表达全部为阳性,而正常对照标本的阳性率仅为33%。作者认为Eag1表达的升高可能是肿瘤发生的早期信号,Eag1钾离子通道不仅可以作为肿瘤标志物、疾病早期标志,也将成为潜在的宫颈癌治疗靶点。Faris等[8]的研究也有相似发现,认为 Eag1钾离子通道的表达与否及其通道活性大小对癌细胞的增殖非常重要,认为其可能成为潜在的宫颈癌细胞膜上的治疗靶点,但是上述研究均未从Eag1的表达情况与宫颈癌临床分期、病理组织类型等方面进行分析,因此,Eag1与宫颈癌之间的相关性仍需进一步研究。

本研究在应用FIGO分期的基础上,采用免疫组化法检测不同宫颈组织中Eag1蛋白的表达,结果显示,在CIN组织中Eag1的表达明显高于慢性宫颈炎组,而宫颈癌组织中Eag1的表达又明显高于CIN组,Eag1表达随临床分期升高显着增高,说明在宫颈癌的生长过程中,Eag1钾离子通道与肿瘤的发生、发展相关。并且随着肿瘤向深层生长,Eag1表达水平更高,推测肿瘤生长过速,缺氧加重,激活更多的基因表达,更能增加它在胞内的水平。本实验结果显示,Eag1的表达水平随病理分级的升高而升高,但各组间比较差异无统计学意义。分析其原因,考虑为不同病理分级的肿瘤组织中均有不同程度的低氧区域所致。本研究的间接免疫荧光结果也显示,在正常培养的Hela细胞内可以检测到明显的绿色荧光,证明其中有Eag1蛋白表达。

随着对Eag1结构和功能的深入研究,发现Eag1通道形成的四聚体中,每一个单体有6个假定的主要包含电压传感蛋白的跨膜区(富含正电荷氨基酸)[9],并且它的细胞内侧端有一个PAS区即为氧感受器,它可根据氧分压PO2的变化调节自身电导系数,推测其与肿瘤乏氧有关[10]。

采用RT-PCR法检测不同氧浓度下 Hela细胞内Eag1 mRNA水平情况,结果显示随氧浓度的降低,Eag1 mRNA水平呈先升高后降低的趋势,轻度缺氧条件下,缺氧作用0.5 h时细胞内Eag1 mRNA水平即开始升高,3 h后达高峰,6 h后尽管有所减弱,但仍强于常氧条件下,提示随缺氧程度加深及时间的延长,Eag1 mRNA水平明显增强。

[1] Camacho J,Saá nchez A,Pardo LA,et al.Cytoskeletal interactions determine the electrophysiological properties of human EAG potassium channels[J].Pflugers Arch,2000,441(2):167.

[2] Wang G,Jiang B,Rue E,et al.Hypoxia-inducible factor 1 is a basic helix loop helix PAS heterodimer regulated by cellular O2tension[J].Proc Natl Acad Sci USA,1995,92(12):5510.

[3] Clifford SC,Astuti D,Hooper L,et al.The pVHL-associated SCF ubiquitin ligase complex:molecular genetic analysis of elongin B and C,Rbxl and HIF-1 alpha in renal cell carcinomal[J].Oncogene,2001,20(36):50672.

[4] Kung A,Zabludoff S,France D,et al.Small molecule blockade of transcriptional coactivation of the hypoxia-inducible factor pathway[J].Cancer Cell,2004,6(1):33.

[5] Swinson DE,Jones JL,Cox G,et al.Hypoxia-inducible factor-1 alpha in non small cell lung cancer:relation to growth factor,protease and apoptosis pathways[J].Int J Cancer,2004,111(1):43.

[6] Kelly BD,Hackett SF,Hirota K,et al.Cell type-specific regulation of angiogenic growth factor gene expression and induction of angiogenesis in nonischemic tissue by a constitutively active form of hypoxia-inducible factor 1[J].Circ Res,2003,11(93):1074.

[7] Fatias L,Deysi B,Lorenza D,et al.Ether a′go-go potassium channels as human cervical cancer markers[J].Cancer Res,2004,64(1):6996.

[8] Faris L,Ocana D,Diaz L,et al.Overexpression of Eag1 potassium channels in clinical tumours[J].Mol Cancer,2006,5(19):596.

[9] Zhong H,Semenza GL,Simons JW,et al.Up-regulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha is an early event in prostate carcinoma[J].Cancer Detect Prev,2004,28(2):88.

[10]Karni R,Dor Y,Keshet E,et al.Activated pp60c-src leads to elevated hypoxia-inducible factor(HIF)-1alpha expression under normoxial[J].J Biol Chem,2002,277(45):42919.

Expression of Eag1 K+channel in cancer of the cervix and the regulation of hypoxia*

LIN Shuang,LI Li△,Y I Ping,et al.

(Department of Obstreics and Gynecology,Daping Hospital,the Third Military University,Chongqing400042,China)

ObjectiveImmunohistochemistry was employed to detect the expression of Eag1 protein in different cervix uteri tissues and CACX Hela cells.MethodsWe determined the effects of different hypoxia time and hypoxic concentration on the expression of Eag1 mRNA in Hela cell by using RT-PCR.ResultsThe expression of Eag1 protein in cervical intraepithelial neoplasia(CIN)tissue was significantly higher than that in normal control group,and the expression in CACX tissue was remarkably higher than that in CIN group.The expression of Eag1 ascended as the development of clinical stage of cervical cancer,but almost irrelevant to pathological grade.Resultsof immunofluorescence and RT-PCR suggested that the expression of Eag1 significantly increased along with the aggravation of hypoxic degree and prolong of hypoxia time.ConclusionEag1 K+channel protein is possible to become diadynamic criteria for new early screening and CACX biological behavioral judgment.Meanwhile,Eag1 plays an important role in hypoxic reception of CACX Hela cell.

cervical cancer;potassium channels;Ether à-go-go

R737.33;R730.43

A

1671-8348(2010)08-0899-03

国家卫生部课题资助项目(WKJ2007-3-001)。△

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2009-08-14

2009-09-08)