冯红超,彭江帆,马 洪,宋宇峰
(贵阳医学院口腔医学系口腔颌面外科教研室,贵阳550004)
肿瘤内浸润的单核/巨噬细胞被称为肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage,TAM),其功能状态的研究对肿瘤的免疫治疗具有重要的意义。由于单核/巨噬细胞不同的表型特征和活化特性与所处的局部微环境有关,而肿瘤组织内局部多处于缺氧状态,本文通过细胞培养的方法进行研究,探讨口腔癌中缺氧的微环境对单核/巨噬细胞功能影响,现报道如下。
1 材料与方法
1.1 试剂 人血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购于上海西唐生物科技有限公司;双抗、淋巴细胞分离液、单核细胞分离液,购于天津市灏阳生物制品科技有限责任公司;抗CD68单克隆抗体、无钙镁PBS液购于武汉博士德生物工程有限公司;RPMI-1640培养液购于美国Gibco公司;胎牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司。
1.2 细胞 Tca-8113人舌鳞癌细胞株,购自中国科学院细胞库/中国科学院上海生命科学研究所细胞资源中心。
1.3 单核/巨噬细胞的培养及获取 采用密度梯度离心法后通过两次贴壁法,获得有大量单个核细胞贴壁的培养板,然后在培养板中加入 RPMI-1640(含10%胎牛血清、1%双抗)在37℃、5%CO2培养箱中继续培养,每隔3 d换液,到第7天时采用机械法收获贴壁的单核/巨噬细胞。用倒置显微镜观察,可见单核/巨噬细胞贴壁细胞逐渐变大,且胞体拉长,呈梭形或多角形,具备典型的单核/巨噬细胞形态。
1.4 流式细胞仪进行鉴定 用抗CD68单克隆抗体分析悬液中的细胞,单核/巨噬细胞定义为CD68阳性细胞,结果CD68阳性细胞占94.03%,满足实验需要。以瑞氏染色计数单核/巨噬细胞数目,胎盘蓝染色计数死细胞,中性红计数活细胞,结果细胞活性大于96%。
1.5 细胞培养方法及检测 将Tca-8113培养上清液(每孔0.3 mL)、巨噬细胞(每孔0.3 mL)加入12孔板中,缺氧组放入密闭的厌氧罐中(37℃、O2＜1%),常氧组在 37℃、20%O2、5%CO2条件下培养,分别在3、5、7 h收集培养上清液,后采用人VEGF ELISA试剂盒进行检测,操作步骤严格按照说明书进行,每组设5个复孔。
1.6 统计学处理 应用SPSS10.0统计软件分析,采用配对t检验及方差分析,以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
缺氧微环境对单核/巨噬细胞分泌VEGF的影响(图1)。在缺氧组培养5 h后,培养液中的VEGF显着增高,7 h达到最高,在3、5、7 h,VEGF分泌量均高于同一时间内的常氧培养条件下的分泌量,差异有统计学意义(P＜0.01),这说明缺氧条件下增加了单核/巨噬细胞分泌VEGF的能力。
图1 缺氧微环境对单核/巨噬细胞分泌VEGF的影响
3 讨 论
本研究显示,在缺氧环境下单核/巨噬细胞分泌VEGF的能力增加。
肿瘤细胞必须依赖于宿主的支持才能够形成肿瘤,包括各种组织细胞、炎细胞、淋巴管、维持肿瘤生长和作为日后远处转移途径的血管等,其共同构成了肿瘤发生、发展的微环境[1]。有研究表明,巨噬细胞是肿瘤间质中细胞数量最多的一种[2]。单核/巨噬细胞具有广泛生物学活性和高度复杂多变的表型,在肿瘤组织中,作为正向调控的效应细胞,其介导直接的抗肿瘤细胞毒性或参与肿瘤相关抗原的提呈,以利于肿瘤的清除;另一方面,在肿瘤细胞组织内单核/巨噬细胞可分化形成具有独特表型的巨噬细胞,这些巨噬细胞可促进肿瘤细胞的增殖及抑制T细胞和自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)的抗肿瘤活性[3-4]。单核/巨噬细胞的功能取决于所处的微环境[5],针对不同的微环境信号行使不同的功能是巨噬细胞的生物学特征。而在实体肿瘤形成过程中,肿瘤生长迅速,随着肿瘤体积的增大,肿瘤内部不能得到足够的血液供应,导致供氧和耗氧的不平衡,许多研究发现肿瘤内部都存在一定程度或一定区域的缺氧,缺氧是大多数实体瘤的特征之一。本课题组的前期研究显示,在口腔鳞癌组织内有大量的巨噬细胞浸润,进一步研究发现口腔癌组织内可以分泌对单核/巨噬细胞有趋化作用的血管细胞黏附分子-1[6],从而促使单核/巨噬细胞在口腔癌中的浸润和聚集。近年来越来越多的证据表明肿瘤组织中的单核/巨噬细胞通过多种途径参与了肿瘤的生长和转移[7-8],本课题组在口腔癌的研究中发现单核/巨噬细胞可以分泌促肿瘤血管生成作用最强的因子之一VEGF[9],而VEGF在口腔癌生长和侵袭转移中起重要作用[10]。口腔癌及其他肿瘤的研究中表明肿瘤组织中浸润的单核/巨噬细胞多聚集在微血管较少的缺氧区域[11-12]。因此本研究推测可能由于局部缺氧的微环境是促使单核/巨噬细胞的功能发生了改变,而本研究进一步证实在局部缺氧的微环境下,单核/巨噬细胞分泌VEGF的能力增加,从而更多地参与了肿瘤的生长和转移。
总之,本研究表明在缺氧的微环境下,单核/巨噬细胞可能通过分泌功能更多的参与了肿瘤的生长,但由于单核/巨噬细胞又具有复杂表型和活化状态,因此其在肿瘤中的具体机制及如何调节其功能均需要进一步的研究。
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