王顺旺,徐 平,刘海军,陈 群,刘艳芳,张 丽,龚其海,李 彬
(1.遵义医学院附属医院神经内科,贵州遵义563003;2.厦门第三医院神经内科,福建厦门361100;3.复旦大学药学院医理系,上海200433)
国内外对体外中枢神经元损伤保护和人为损伤单侧大鼠海马建模的研究已经开展较多,而使用颅钻钻孔微注棒Aβ25-35注射损伤双侧大鼠海马和反式白藜芦醇(trans-resveratrol,TR)保护海马组织的动物研究目前较少开展。动物实验表明,反式白藜芦醇葡糖苷(trans-resveratrol-3-O-glucoside,TRG)在防止动脉内皮损伤性血栓形成,改善休克微循环,提高休克大鼠存活率,减轻缺血再灌注、自由基和内毒素造成的组织器官损伤,降血脂及抗脂质氧化和抗血小板聚集等方面具有良好的作用[1-4]。肠黏膜在 TRG脱糖代谢中起着非常重要的作用,TR主要在肠黏膜代谢,灌胃给药吸收好,推测TRG的脱糖代谢与黄酮苷类化合物类似,也是在大鼠肠黏膜中β2葡糖苷酶的催化下进行的[5],所以选择灌胃给药。本研究通过观察使用TR来干预痴呆大鼠模型的效果,以探求临床上痴呆患者理想药物治疗的实验研究方法。
1 材料与方法
1.1 药物 TR粉剂(淡黄色),购自天津游龙发展有限公司。苦味酸购自生工生物工程(上海)有限公司,Aβ25-35购自SIGMA公司(Amyloidβ-Protein Fragmene 25-35批号:A4559),RNAiso Regent液、逆转录试剂、荧光液Green Supermix等PCR试剂购自大连宝生物公司。iNOS优化引物由本院药理系美籍客座教授刘杰博士赠送。
1.2 仪器 冷冻离心机(德国5417R)、紫外可见分光光度计(TU-1810)、多功能梯度 PCR仪(德国22331)、实时荧光定量PCR仪(美国 Icycler IQ)、双臂脑立体定位仪(68002型 RWD life science co)、颅钻(78001型)、超微量注射棒、Morris水迷宫(MWM)等。
1.3 方法
1.3.1 分组及制模 制模选用重庆腾鑫生物技术有限公司提供的SPF级SD雄性大白鼠 65只,体质量为 300～350 g[许可证号scxk(渝)2007-0005]。MWM训练3 d成绩稳定后,剔除逃避潜伏期小于5 s和大于50 s的大鼠,合格的60只随机分为5组:假手术组(sham),模型组(model),TR 高、中、低剂量组。模型组及TR高、中、低剂量组制模。制模药物 Aβ25-35在常温下用生理盐水溶解成浓度为1μg/μL溶液,在孵育箱中37℃孵育12 h后备用。取SD大鼠1只称重,用5%水合氯醛0.7 mL/100 g麻醉。采用腹腔注射麻醉法,麻醉后将大鼠固定于脑立体定位仪上,局部头顶去毛、消毒,正中矢状位切口,将骨膜分离、剥除,确定前、后囟,并使之处于同一水平面上,取前囟为0点,在前囟左、右侧2.5 mm,后5.0 mm处用颅钻钻透颅骨,钻孔直径1 mm,自颅骨表面垂直进针于3.5～4.0 mm深处(此处为海马所在部位),每侧用微量加样器加 10μL Aβ25-35溶液[6],每侧注射结束后留针5 min,用牙托粉和 502胶混合物封闭钻孔[7],缝合切口。假手术组给等体积的生理盐水代替 Aβ25-35。
1.3.2 给药 选用TR粉剂(淡黄色),用生理盐水溶解成1%的TR溶液,制模结束大鼠清醒后开始灌胃给药。TR高、中、低剂量组分别为 TR40、20、10 mg/(kg◦ d),假手术组、模型组给等体积的生理盐水(NS,1 mL/100 g体质量),共10 d。
1.3.3 行为学检测 在制模后第11天开始采用MWM检测大鼠的空间辨别学习记忆能力。检测前1 d将大鼠置于无平台的MWM 中2 min,使其知道无法逃避的水准,检测的第1～4天进行定向航行实验,第5天行空间搜索实验。
1.3.4 取材 在制模后第11天每组取大鼠7只经10%水合氯醛(0.8 mL/100 g)麻醉,断头取脑,切取双侧海马组织放入加有0.5 m LRNA萃取液的Ep管中,-80℃速冻备检测。
1.3.5 RT-PCR法检测大鼠海马iNOS的表达 (1)RNA提取。①匀浆:取冷冻于0.5 m L RNAiso Regent液的大鼠海马及其周边皮质样本,研磨杵充分匀浆;②萃取:0.5 mL匀浆加氯仿0.5 m L,快速摇匀,离心12 000 r/min,4℃,10 min,取出上清液并定量;③沉淀:加等量于上清液样的异丙醇,离心12 000 r/min,4℃,10 min,弃去上清液;④清洗:加入 75%的乙醇0.5 mL,12 000 r/min,4℃,7 min,小心弃去乙醇上清液;⑤空干:滤纸上倒置;⑥溶解:焦碳酸二乙酯(DEPC)水 50μL溶解。(2)RNA纯化、纯度和含量测定、逆转录及扩增按文献[8]及试剂盒说明书进行,但所加入的引物不同。目的基因表达的相对定量法:以PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数(cycle threshold,Ct值)为统计参数,依次计算下列数据,Ct值的平均值=(Ct1+Ct2)/2(重复管);dCt=Ct值的平均值-中间值(相同检测基因的不同样品Ct值的平均值中居中的值);基因的表达=2-d Ct。
1.3.6 原位末端标记(TUNEL)法检测 TUNEL法检测大鼠海马细胞凋亡情况:海马标本制成石蜡包埋块,切片(经前联合冠状切片厚6μm),用防脱载玻片制作石蜡切片病理标本,脱蜡水化,PBS冲洗 2次(每次 3 min,下同)。在 0.1%TrionX-100枸橼酸钠渗透液冰上(2～8℃)孵育 8 min,PBS冲洗2次。擦干组织周围水分,每片加50μL TUNEL反应液(新鲜配制,取 Enzyme Soultion液1份加入 Label solution液 9份混匀离心,冰浴备用。阴性对照2张片子不用TUNEL反应液,只加50μL Label solution液)于湿化盒中37℃、避光孵育 60 min,PBS冲洗3次。擦干组织周围水分,严格按照Roche公司试剂盒说明书操作,采用DAB显液,光镜下观察阳性细胞核呈棕黄色颗粒状,凋亡细胞的细胞核染色质为新月型或蚕豆状棕黄色浓染,并可见核碎裂小体。在高倍镜下(×400)下计算凋亡指数(apoptotic index,AI),即每张片选取不重叠10个细胞数最多的高倍视野计算出每个视野中凋亡细胞与总细胞数的百分比,计算8个视野的平均凋亡细胞百分数及平均凋亡细胞百分数(每组7个样本切片)。
1.4 统计学处理 应用SPSS16.0统计软件分析,所有数据以±s表示,组间比较用单因素方差分析结合LSD检验分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 MWM结果 逃避潜伏期是检测大鼠学习记忆一个重要指标,是实验室常用的行为学检测指标,正常大鼠一般在12 s以内,本实验第1～4天定位航行实验的逃避潜伏期(s)依次是:假手术组4 d检测的均值分别为(8.86±3.26)s、(7.87±2.72)s、(6.89±3.71)s、(5.39±3.11)s;模型组 4 d 检测的均值分别为(80.59 ±22.73)s、(79.58 ±28.91)s、(60.01 ±25.89)s、(57.63±20.67)s;TR高剂量组检测的均值分别为(13.67±3.71)s、(10.68±2.76)s、(12.36±5.95)s、(10.50±3.67)s;TR中剂量组检测的均值分别为(19.37±11.76)s、(21.28±5.46)s、(17.38±6.71)s、(28.99±5.02)s;TR 低剂量组检测的均值分别为(40.82±13.21)s、(45.26±11.70)s、(36.97±6.71)s、(32.66±7.83)s。上面数据表明,TR对海马内注射Aβ25-35所致大鼠学习记忆减退的影响是明显的(封2图1、2),TR高剂量组和模型组差异有统计学意义(P＜0.05)。TR高剂量组和 TR中剂量组组间差异无统计学意义(P＞0.05,图3),低剂量组和模型组及低剂量组和TR高剂量组、TR中剂量组相比较差异有统计学意义(P＜0.05)。
2.2 RT-PCR检测结果 假手术组、模型组及TR高、中、低剂量组中PCR法检测各组iNOSm RNA表达分别为0.23±0.90、1.23±0.91、0.34±0.18、0.48±0.12、0.87±0.49。 TR对海马内注射Aβ25-35大鼠的海马iNOS m RNA在各组表达的影响,见图3。TR高剂量组表现为iNOS mRNA表达减少,其与模型组的表达差异有统计学意义(P＜0.01)。
图3 TR对痴呆大鼠海马iNOS的m RNA表达的影响
2.3 TUNEL法检测结果 TUNEL法检测大鼠海马组织每个视野的假手术组、模型组及TR高、中、低剂量组的凋亡细胞百分比第11天分别为:(3.23±0.52)%、(21.32±5.02)%、(5.72±1.56)%、(7.21±1.22)%、(10.93±3.25)%;术后第17天分别为:(3.21±0.29)%、(16.31±4.27)%、(5.13±2.00)%、(7.12±1.78)%、(9.84±2.66)%。TR对海马内注射Aβ25-35大鼠的海马细胞凋亡的影响(封 2图 4,图 5,表 1)。假手术组凋亡细胞百分明显低于模型组的凋亡百分比,TR高剂量组和模型组凋亡百分比的差异有统计学意义(P＜0.01)。
表 1 TUNEL法测 TR对 Aβ25-35致痴呆大鼠脑细胞凋亡的影响
图5 TUNEL法检测TR干预对痴呆大鼠海马细胞凋亡的影响结果折线图
3 讨 论
实验设计分析如下:白藜芦醇(resveratrol,Res)是虎杖中有效成分,中药虎杖中的Res含量最高 。Res药理作用广泛,主要包括:抗氧化、清除自由基、神经保护、抗炎等作用,对机体损伤的保护作用、植物雌激素作用及对骨代谢的影响等。其神经保护作用表现在体外(离体情况)抑制Aβ的聚集[9]。Res包括顺式Res和TR,研究表明 TR有抗氧化、清除自由基、神经保护等作用,TR活性较顺式Res活性高,能够通过血脑屏障。而本课题的前期体外实验也发现Res对原代培养大鼠脑皮层神经元氧糖缺失损伤的保护[10],所以选用TR作为干预药是前期课题的研究延伸。本课题组在研究银杏叶提取物减轻缓激肽诱导的大鼠记忆减退中已得出,减轻大鼠学习记忆减退可能与实验用药抑制海马caspase-3和caspase-8 mRNA表达有关。国内研究表明,大鼠学习和记忆功能下降与NOS过度表达引起的神经毒性作用有关。通过抑制神经元型一氧化氮合酶(nNOS)和iNOS的活性或表达的药物可以起到神经保护作用,改善了大鼠的学习和记忆功能[11]。而能明显抑制脂多糖(LPS)引起的脑细胞炎症反应的药物也可以通过下调iNOS的表达起到保护脑细胞的作用[12]。Aβ25-35对海马的毒副作用会引起iNOS的过度表达及激活,从而产生大量的一氧化氮(NO)。本实验选用iNOS优化引物主要因为iNOS的表达是和促凋亡蛋白激酶、caspase-3的活动是相关的[13],用优化的iNOS引物作为观测指标目的是起到替代caspase-3引物的作用,甚至有可能通过检测其表达来说明TR起到iNOS抑制剂作用,能减轻Aβ25-35对海马细胞的毒害作用,进而更好说明TR对痴呆模型大鼠的保护作用。
本实验采用颅钻双侧颅顶钻孔造模,用Aβ25-35破坏双侧大鼠海马起到很好致痴呆作用(海马在学习和记忆中起着重要的作用,所以本实验选海马细胞凋亡程度作为造模成功指标之一)。而选用10 d灌胃法是在既往研究基础上得出,本实验与前人造模实验有一致性,即术后1周左右模型组凋亡细胞比假手术组明显增多[7]。制模后模型组大鼠可以观察到:行动迟缓、活动减少、反应迟钝、神情淡漠等临床神经行为学改变,水迷宫结果(封2图1、2)表明模型组与假手术组差异明显(P＜0.01),结合前文的病理图片(封2图4中B所示)可见造模后模型组大鼠海马区出现变性坏死神经元,神经元存活数目减少,以上说明造模成功。本文特意做了灌胃10 d((术后第11天)和(术后第17天)病理比较,从表1和图5的统计学分析得出实验灌胃10 d和灌胃16 d差异无统计学意义(P＞0.05),从而得出灌胃10 d可能是合理的。从PCR检测iNOS的m RNA的表达结果统计分析可得出,TR对iNOSmRNA表达水平的下调在假手术组与模型组;TR高剂量组、TR中剂量组、TR低剂量组与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.01),TR高剂量组与低剂量组之间比较差异也有统计学意义(P＜0.01,图3)。从图5得出各剂量干预组的组织病理改变较模型组在术后第11天和术后第17天均有不同程度的改善。假手术组与高剂量组相比逃避潜伏期、iNOSmRNA表达水平差异无统计学意义(P＞0.05)(图2、3),表明高剂量组治疗效果可能接近正常水平。总之以上说明TR在本实验中对痴呆大鼠的干预是有效,而且与剂量有关。实验结果表明:TR对Aβ25-35引起的脑细胞的炎症及凋亡反应有抑制作用,从而说明TR对海马损伤模型大鼠可能起部分保护作用,其机制可能与其抑制Aβ25-35引起的炎症反应、下调 iNOS表达、减轻神经元的损伤有关。
(志谢:本实验得到本院“贵州省基础药理重点实验室”的神经药理课题组大力帮助,感谢刘杰博士、吴芹高级技师的指导)
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