张巧琳，徐 新，刘 琪，罗春丽
(重庆医科大学检验系教育部重点实验室 400016)
c-Myc是从鸡病毒V-myc癌基因和同源物中分离出来的原癌基因，在细胞增殖、凋亡和分化等进程中起重要作用。c-Myc因基因扩增、染色体易位、突变在多种肿瘤中表达失控，参与肿瘤进程[1]。通过微阵列和实时定量PCR发现c-Myc在肾癌中因基因扩增和染色体易位呈高表达，其表达量与患者的预后相关[2]。有学者进一步研究证实，c-Myc通路在肾癌中呈持续活化状态，体外 RNAi技术沉默c-Myc基因能有效抑制肾癌增殖、凋亡并可调节相应下游分子[3]，但基因沉默对于肿瘤细胞的靶向作用有限。
c-Myc编码产物为转录因子，主要与Max蛋白形成二聚体调节相应下游分子从而调节肿瘤进程。10058-F4是c-Myc小分子抑制剂，可下调c-Myc蛋白表达并特异性阻止c-Myc-Max复合物形成[4-6]。因此，本次实验预用c-Myc-Max二聚体小分子抑制剂10058-F 4研究其对肾癌786-0细胞增殖和凋亡的作用，探讨其潜在治疗作用。
1 材料与方法
1.1 细胞系和主要试剂 786-0细胞株由本室保存，anti-c-Myc、anti-Bcl-2、anti-p27、anti-p21 和 anti-β-actin 的一抗及辣根过氧化物酶标记的抗鼠 IgG均购自 Santa CruZ公司，RPMI1640和小牛血清购自Gibco公司，M TT购自美国Sigma公司，10058-F 4购自Sigma公司。
1.2 细胞培养 人肾细胞癌786-0细胞用含10%新生牛血清的RPM I1640培养液，置于37℃、含CO2体积分数为5%的培养箱中培养，常规换液传代。
1.3 M TT检测 取对数期生长的786-0细胞2～5×104个/m L 100μL接种于96孔板，待细胞贴壁后加入图1A所示浓度的10058-F 4，将其每组细胞做5个复孔，37℃、5%CO2培养箱中孵育，培养不同的时间点后，每孔加入M TT(5 mg/m L)20 μL，继续培养4 h，弃上清液，每孔加 150μL DMSO，用酶标仪570 nm处测吸光度值。细胞增殖活力按公式计算:细胞生长抑制率=[1-(OD实验-OD调零)/(OD对照-OD调零)]×100%。
1.4 FCM检测 取对数生长的786-0细胞接种于50 mL培养瓶中，待细胞贴壁后加入 60、100μM 的10058-F4，加药后继续培养细胞24 h，用0.25%胰酶消化，PBS洗 3次，600×g离心5 min，加入70%乙醇固定细胞，1000×g离心10 min去固定液，加入碘化丙啶染色液[1×PBS，0.1%Trton X-100，碘化丙啶(20μg/m L)，RNase A(100μg/m L)]，室温染色30 min，上流式细胞仪分析细胞周期，采用PI/annexin-V染色用于检测细胞凋亡，取1×105个细胞加入5μL Annexin V-PE及 10 μL的7-AAD，轻轻混匀，避光保存 20 min，加入 200μL缓冲液，立即用流式细胞仪检测细胞凋亡。
1.5 Western blot法检测 细胞用预冷的 PBS洗3次，用细胞刮收集细胞于离心管中，800×g离心 5 min，转移到EP管中，3000×g离心 5 min，加入 RIPA 裂解液，冰上放 30 min，13000×g离心30 min收集上清液，用考马斯亮蓝于酶标仪上测浓度，加入蛋白上样缓冲液100℃变性5 min，每个上样孔上相同浓度的蛋白，每孔约 50μg，SDS-PAGE，半干转于 PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭3 h，一抗 4℃过夜，TBS T洗膜 3次，每次10 min，二抗室温孵育 1 h，TBST洗膜，3次/10 min，ECL显色。
1.6 统计学处理 采用S PSS13.0统计软件进行分析，结果以表示，以 P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 10058-F 4抑制肾癌细胞786-0增殖及c-Myc蛋白表达MTT检测结果显示，加入c-Myc小分子抑制剂10058-F4后，抑制肾癌细胞786-0增殖，且呈浓度依赖性(P＜0.05，图 1A)和时间依赖性(P＜0.05，图 1B)，Western blot法检测结果显示10058-F 4能明显抑制c-M yc蛋白水平表达，并呈浓度依赖性(P＜0.05)，见图1C。
图1 10058-F4对肾癌786-0细胞增殖及c-Myc蛋白表达的影响
图2 10058-F 4对肾癌786-0细胞周期和凋亡的影响
图3 Western blot法检测10058-F4对肾癌786-0细胞p21、p27和Bcl-2蛋白表达
2.2 10058-F 4阻止786-0细胞周期并诱导凋亡 用流式细胞仪检测细胞周期结果显示，60μM 和 100μM 的 10058-F4均可阻止786-0细胞周期于G0/G1期(P＜0.05)，见图2A，进一步PI/annexin-V双染流式检测显示，100μM的10058-F4作用786-0细胞24h可诱导细胞凋亡，但作用不明显，进一步检测其48 h时细胞凋亡，发现其凋亡细胞增多，对照组细胞凋亡率为(6.2±0.91)%，60μM 的 10058-F4细胞凋亡率为(13.07±0.64)%，100μM 的10058-F4细胞凋亡率为(17.97±0.55)%(P ＜0.05)，见图2。
2.3 10058-F 4影响p21、p27和 Bcl-2蛋白表达 Western blot法检测结果显示，10058-F4可上调p21和p27蛋白表达，并明显下调Bcl-2蛋白，且呈浓度依赖性(P＜0.05)，见图3。
3 讨 论
c-Myc及其所调节的信号通路在肾癌的发生过程中发挥着重要的作用，抑制 c-Myc表达能有效抑制肾癌生长[3，7]。目前主要采用RNAi技术和寡义核苷酸链等抑制c-Myc表达，但这些技术对肿瘤靶向具有局限性。研究发现，c-Myc主要与Max等形成二聚体调节肿瘤恶性生物学行为，小分子抑制剂10058-F4可特异性抑制c-Myc-Max形成。本次研究采用c-Myc小分子抑制剂10058-F4作用于肾癌786-0细胞，发现其能有效抑制肾癌细胞增殖并诱导其凋亡。
c-M yc蛋白属于具有DNA结合域的转录因子，对细胞周期起正向调节作用，c-Myc基因激活导致大量G0期细胞提前进入细胞周期，推动G0/G1期细胞向S期转变[8]。本研究发现，c-Myc小分子抑制剂 10058-F 4，抑制肾癌 786-0细胞增殖并明显阻止细胞周期于G0/G1。p21、p27是细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白，通过抑制CDK的激活使细胞周期阻止于G1期，同时 p21、p27是 c-Myc的靶基因[9]。10058-F4可明显上调p21、p27蛋白表达水平。p21、p27作为c-Myc的靶基因，当c-Myc蛋白水平降低和Max形成二聚体减少，对下游分子的调节作用减弱，p21、p27所受抑制作用相应减弱，表达上调。10058-F4有可能是通过抑制c-Myc活性及与Max二聚体的形成，间接上调 p21、p27蛋白表达，从而抑制肾癌细胞增殖，阻止细胞周期于G0/G1。进一步研究发现，10058-F 4可诱导 786-0细胞凋亡并可下凋c-Myc凋亡相关下游分子Bcl-2蛋白水平，但在24 h时作用并不明显，随着时间延长，诱导凋亡作用增加，呈现时间依赖性，这可能是由于细胞内被抑制的目标蛋白有一定的半衰期，只有当目标蛋白降解以后，10058-F4的抑制效应才显现出来。
c-Myc在多种肿瘤中表达失控，如参与肿瘤的发生，其中包括肾癌，下降c-Myc性活能有效阻止肿瘤进程。c-Myc有望成为肿瘤治疗的新靶点，c-Myc小分子抑制剂10058-F4特异性下调c-Myc表达，抑制c-Myc功能二聚体形成，间接有效调节c-Myc靶基因，有望为肾癌治疗开辟新途径。
[1]popescu NC，Zimonjic DB.Chromosome-mediated alterations of the MYC gene in human cancer[J].J Cell Mol Med ，2002，6(2):151.
[2]Jon AJ，Lovisol O ，Casati B，etal.Gene expression proling of renal cell carcinoma:a DNA macroarray analysis[J].BJU Iint，2006 ，98(1):205.
[3]Tang SW ，Chang WH ，Su YC ，etal.M YC pathw ay is activated in clear cell renal cell carcinoma and essential for proliferation of clear cell renal cell carcinoma cells[J].Cancer Letters，2009，273(1):35.
[4]Berg T ，Cohen SB，Desharnais J，et al.Small-molecule antagonists of Myc/Max dimerization inhibit Mycinduced transformation of chicken embryo fibro-blasts[J].Proc Natl Acad Sci USA，2002，99:3830.
[5]Yin X，Giap C ，Lazo JS，et al.Low molecular weightinhibitors of Myc-Max interaction and function[J].Oncogene，2003，22:6151.
[6]Mo H，Henriksson M.Identification of small molecules thatinduce apoptosis in a Myc-dependentmanner and inhibit Myc-driven transformation[J].Proc Natl Acad Sci USA，2006，103:6344.
[7]Shachaf CM ，Kopelman AM ，Arvanitis C，et al.MYC inactivation uncovers pluripotent differentiation and tumour dormancy in hepatocellular carcinoma[J].Nature，2004，431:1112.
[8]Morrish F ，Neretti N ，Sedivy JM ，et al.The oncogene c-Myc coordinates regulation of metabolic networks to enable rapid cellcycle entry[J].Cell Cycle，2008 ，7(8):1054.
[9]Coqueret O.New roles for p21 and p27 cell-cycle inhibitors:a function for each cell compartment[J].Trends Cell Biol，2003 ，13(2):65.
[10]Saw yers CL.Making progress through molecular attacks on cancer[J].Cold Spring Harb Sym p Quant Biol，2005，70:479.
