郝雪琴,孔 涛,李晓辉
(1.河南科技大学动物科技学院药理学教研室,洛阳 471003;2.第三军医大学药学院药剂学教研室,重庆 400038)
孕期脂多糖刺激诱导子代大鼠高血压的机制研究
郝雪琴1,2#,孔 涛1,李晓辉2△
(1.河南科技大学动物科技学院药理学教研室,洛阳 471003;2.第三军医大学药学院药剂学教研室,重庆 400038)
目的探讨孕期脂多糖刺激诱导子代大鼠(简称子鼠)高血压的机制研究。方法将SD孕鼠6只随机分为两组。对照组 3只:腹腔注射无菌生理盐水 0.5 mL;脂多糖组 3只:腹腔注射脂多糖,剂量为 0.79 mg/kg。分别在孕期第8、10、12天08∶00～09∶00进行腹腔注射。子鼠出生后,观察7～25周龄子鼠血压的变化和肾组织肾素mRNA表达、血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1-R)的蛋白表达以及肾组织血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)阳性细胞表达。结果与对照组相比,脂多糖组子鼠血压逐渐升高,至24周龄时达到高血压水平。血浆肾素活性和AngⅡ浓度无变化。7、16、25周龄子鼠肾内肾素mRNA表达和AngⅡ阳性细胞数与对照组相比明显增高,并与血压呈正相关;AT1-R的蛋白表达与对照组相比降低,与肾素mRNA表达呈负相关。结论孕期暴露于脂多糖引起子代成年大鼠肾组织肾素-血管紧张素系统活性增高,这可能是血压升高的一个机制。
炎症;脂多糖类;肾素-血管紧张素系统;高血压
1 材料与方法
1.1 实验动物分组及模型制备 SPF级SD大鼠购自第三军医大学附属大坪医院实验动物中心,动物实验合格证号:SCXK(渝)2002003。成年雌雄大鼠按 4∶1合笼交配,室温[(24±1)℃]环境下喂养。分别于合笼次日 07∶00与19∶00做雌鼠阴道检查,有阴道栓或阴道涂片精子呈阳性者定为妊娠第0天。选取6只孕鼠随机分为两组。对照组3只:腹腔注射无菌生理盐水0.5 mL;脂多糖组3只:腹腔注射脂多糖,剂量为0.79 mg/kg。分别在孕期第8、10、12天08∶00～09∶00进行腹腔注射,注射后轻柔腹部片刻,促进药物吸收。
1.2 血压的测定 子鼠血压的测定从7周龄开始,每3周测1次至25周龄。采用尾套法大鼠尾动脉血压测定方法[6]。均在15∶00～18∶00进行,具体操作如下:在安静环境下,保持室温 25℃,测压前在 40℃条件下将大鼠预热 10 min,放于固定装置中,待大鼠安静后,将尾动脉无创测量仪的尾部气囊和脉搏换能器依次套于大鼠尾部近心端,换能器表面对准尾腹面,尾部气囊与换能器均通过生理四通道信号采集仪连于电脑,调整鼠尾和换能器接触部位,待收集信号稳定后,充气加压,直到脉搏信号成为一条直线,此时大鼠尾动脉血流被完全阻断,然后逐渐放气减压,待脉搏信号出现规则波形,电脑中与气囊相连所采集的信号与脉搏信号第一波同步所指示的压力值,即为大鼠尾动脉收缩压。每只大鼠每隔3 min测1次,连续测 3次,取平均值。
1.3 标本的采集 子鼠出生后,母乳喂养1个月后给予实验大鼠标准饲料喂养,分别在7、16、25周龄时处死取肾脏用于检测肾素mRNA表达及血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1-R)的蛋白表达,并用免疫组织化学法检测血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)表达阳性细胞。
1.4 real-time PCR检测肾组织肾素mRNA的表达 总RNA的提取采用T rizol法,用一步法 cDNA合成试剂盒(东洋纺有限公司生化业务部)在 Thermo Hybaid PXL上进行反转录。所有引物应用Premier 5.0软件设计,由上海生工合成,以βactin作为内参照。引物序列为大鼠肾素(正义链:5′-GGG TGC TAA AGG AGG AAG TGT T-3′,反义链:5′-AGT GAA AGT TGC CCT GGT AAT G-3′)、大鼠 β-actin(正义链:5′-GAC GTT GAC ATC CGT AAA GAC C-3′,反 义链:5′-TAG GAG CCA GGG CAG TAA TCT-3′)。 real-time PCR 采用20 μ L反应体系,应用绿色荧光定量聚合酶链反应,反应条件:95℃2 min,95℃10 s,59℃15 s,循环 40次,然后72℃20 s[7]。
1.5 Western blot检测肾组织AT1-R的蛋白表达 提取肾脏总蛋白,用考马斯亮蓝G250比色法测定蛋白质浓度。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),湿转膜,5%脱脂奶粉封闭2 h。一抗AT1-R抗体(1∶1 000,Abzoom,USA)4℃孵育过夜,含0.1%Tween的 TBS缓冲液(TBST,30 mL)洗膜5次,每次10 min;二抗山羊抗兔 IgG(1∶2 000,北京中杉金桥生物技术有限公司)室温孵育1 h,含0.1%Tween的TBS缓冲液(TBST,30 mL)洗膜5次,每次10 min;PVDF条带浸入ECL化学发光液(美国Pierce公司,A、B液1∶1混合)发光5 min后暗室进行曝光、显影。β-actin抗体(1∶5 000,Sigma公司,USA)4℃孵育过夜[8],其他处理方法同上。
1.6 免疫组织化学法检测肾组织AngⅡ表达阳性细胞 标本用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,切成4 μ m厚切片,脱蜡至水,胃蛋白酶消化液(北京中杉金桥生物技术有限公司)37℃作用10 min,0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次,每次5 min,0.1 mol/L PBS洗3次,每次5 min。3%过氧化氢作用15 min,PBS洗3次,每次5 min。5%牛血清蛋白(BSA)封闭 15 min。滴加一抗AngⅡ 抗体(1∶100,Chemicon公司,Canada)4℃作用12 h,0.1 mol/L PBS洗3次,每次 5 min。滴加山羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体(北京中杉金桥生物技术有限公司)37℃孵育30 min,PBS洗3次,每次 5 min。DAB显色。Ang-Ⅱ阳性细胞细胞质呈棕褐色染色。
2 结 果
2.1 大鼠尾动脉血压变化 从7周龄开始,脂多糖组子鼠平均动脉压呈持续增高趋势,明显高于对照组(P＜0.01)。25周龄时,脂多糖组子鼠平均动脉压已经达到142 mm Hg,明显高于对照组的114 mm Hg(P＜0.01),见图1。
2.2 肾组织肾素mRNA表达 7、16、25周龄脂多糖组子鼠肾素mRNA的表达明显高于对照组,并有随年龄增长而逐渐增高的趋势(P＜0.01),见图2。
2.3 肾组织AT1-R蛋白的表达 7、16、25周龄脂多糖组子鼠肾皮质AT1-R蛋白的表达比对照组显着降低(P＜0.01),见图3。
2.4 AngⅡ在肾组织中的表达 免疫组织化学结果显示AngⅡ主要表达在近端小管上皮细胞,见封 3图 4;7、16、25周龄脂多糖组子鼠肾脏AngⅡ组阳性表达细胞数明显高于对照组,见图5。
图1 两组子鼠平均动脉血压比较
图2 两组子鼠肾素mRNA表达的比较
图3 两组子鼠肾组织AT1-R蛋白表达的比较
图5 两组子鼠肾脏AngⅡ阳性细胞数比较
3 讨 论
肾素-血管紧张素系统是一个激素的级联反应,对动脉血压和血管容量的维持、组织灌注起着重要的调节作用。肾素-血管紧张素系统由肾素分泌启动,催化血管紧张素原氨基端水解生成血管紧张素Ⅰ(AngⅠ),AngⅠ又被血管紧张素转化酶水解生成AngⅡ。AngⅡ是一强效的血管收缩剂,是肾素-血管紧张素系统的重要活性成分,在高血压的发生、发展以及靶器官的损害中起着十分重要的作用[9-12]。
本研究成功地复制了孕期暴露于脂多糖引起子鼠高血压的模型,并发现肾皮质肾素活性和AngⅡ阳性细胞数与血压的升高呈正相关,表明肾素-血管紧张素活性的增高参与了孕期暴露于脂多糖引起的血压增高。前期有研究表明孕期脂多糖引起子鼠肾脏发育异常,肾小球减少。因此,可能的机制是残余的肾小球超负荷工作引起肾小球肥大,激活了肾素-血管紧张素系统,导致血压增高[13-14]。
本研究中肾脏AngⅡ阳性细胞数与血压升高呈正相关,这与以往研究结果一致。在对盐敏感性高血压的研究中发现,血压的升高与肾脏AngⅡ呈正比,而与血浆AngⅡ浓度呈负相关,而且,肾脏AngⅡ与肾组织 AngⅡ阳性细胞数呈正相关[10]。这表明肾组织肾素-血管紧张素系统的活性在高血压的发生中起着重要的作用。
肾组织AT1-R的蛋白表达与肾素活性和血压的增高呈负相关,可能的原因是肾素的增高诱导了AngⅡ受体的下调,是机体负反馈调节的结果。
总之,孕期暴露于脂多糖引起子鼠肾组织肾素-血管紧张素活性增高,AT1-R受体密度下调,为高血压的防治提供了新的思路。
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Effects of maternal lipopolysaccharide on intrarenal renin-angiotensin system in offspring rats
Hao Xueqin1,2#,Kong Tao1,Li Xiaohui2△
(1.Departmentof Pharmacology,Animal Science and Technology College,HenanUniversity of Science and Technology,Luoyang,Henan 471003,China;2.Department of Pharmaceutics,Pharmaceutical College,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China)
ObjectiveTo explore the mechanism of hypertension caused by maternal exposure to lipopolysaccharide in adult offspring rats.MethodsNulliparous,pregnant,time-matched SD rats were randomly divided into two groups(n=3):control group and LPS group.On the pregnant day 8,10 and 12,rats in control group and LPS group were administered intraperitoneally with saline 0.5 mL or LPS 0.79 mg/kg,respectively.The systolic blood pressure was measured in offspring once three weeks from 7 weeks of age to 25 weeks of age.The plasma renin activity and angiotensin II concentration were measured in adult offspring rats at 7,16 and 25 weeks of age,intrarenal renin was assessed by real-time PCR,A T1-R protein expression was assessed by Western blot and angiotensinⅡ-positive cells were determined with immunohistochemical staining.ResultsThe blood pressure in offspring of LPS-treated rats increased constantly and reached hypertensive level at 24 weeks of age.The intrarenal renin mRNA expression and the number of angiotensinⅡ-positive cells increased at 7,16 and 25 weeks of age,while the AT1-R protein expression decreased.The plasma renin activity and angiotensinⅡwere unchanged.ConclusionMaternal exposure to lipopolysaccharide activates intrarenal renin-angiotensin system in adult offspring rats.
inflammation;lipopolysaccharides;offspring,renin-angiotensin system;hypertension心血管疾病是当今威胁人类健康最严重的疾病之一,其发病率和病死率已超过肿瘤而跃居第一。高血压是心血管疾病最主要的危险因素之一,其根本病因目前已知的有遗传因素、环境因素、炎症因素、精神因素等。近年来许多研究表明,生命早期刺激可引起子代大鼠(简称子鼠)高血压[1-5]。既往有研究表明孕期暴露于脂多糖或酵母多糖(zymosan)引起子代成年大鼠高血压,但其机制尚不清楚[6]。本研究通过模拟孕期暴露于脂多糖引起子鼠高血压的模型,研究肾脏肾素-血管紧张素系统在孕期暴露于脂多糖引起的子鼠高血压中的作用。
10.3969/j.issn.1671-8348.2011.05.012
A
1671-8348(2011)05-0445-03
△通讯作者,Tel:(023)68752318;E-mail:lpsh008@yahoo.com.cn。#博士。
2010-06-09
2010-08-22)
·论 着·
