99 Tcm标记Gd-DTPA-DG及其在裸鼠体内的生物分布*

黄占文,张 伟,陈 跃

(泸州医学院附属医院核医学科,四川泸州646000)

肿瘤靶向成像是近年来分子影像学研究的热点之一[1-2]。分子影像学就是致力于采用非侵袭性手段来鉴别正常细胞与非正常细胞在早期病理结构发生改变之前的特征性生物标志物的变化。对于隐匿性生物标志物的检测,在肿瘤当中,只要求高灵敏度的探测器使用低分辨率的扫描技术,但要定量判断和定性这些肿瘤组织的病理学特征必须要高清晰度的成像。核医学显像可以高度灵敏的检测这些微量生物标志物,但是这些技术与磁共振成像相比,分辨率就逊色得多[3]。而多学科交融的双模式、多模式影像探针提供了一个全新的研究角度,国外已有相关报道[4-8],而国内对此类多模式影像探针研究尚少。本课题前期研究发现,锝(99Tcm)标记二乙三胺五乙酸-脱氧葡萄糖(DTPA-DG)能够参与多种肿瘤细胞增殖,反映细胞核活性,并可用于早期探测肿瘤病灶及化疗效果评价[9-11];钆离子(Gd3+)具有很强的顺磁作用,在磁共振对比剂中应用最多,若能把Gd3+同DTPA-DG结合并进行99Tcm标记,将会是一种很有发展潜力的双模式影像探针。本研究拟在二乙三胺五乙酸-脱氧葡萄糖钆盐(Gd-DTPA-DG)的基础上,对其进行99Tcm标记,确定最佳标记反应条件,观察其在裸鼠体内的生物分布情况,并探讨其作为一种双模式影像探针的可能性。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)3周龄雄性 BalB/c裸鼠24只,体质量(18±3)g,SPF三级,由四川大学实验动物中心提供;(2)实验材料为氯化亚锡(SnCl2◦2H2O,成都科龙化工试剂厂生产)、胰蛋白酶(北京博奥森生物技术有限公司生产)、DMEM培养基(GIB-CO/BRL公司生产)、小牛血清(郑州佰安生物工程有限公司生产)、胰酶和青霉素链霉素双抗(GIBCO/BRL公司生产)、新华1号层析纸:杭州新华纸业公司生产)、99Mo-99Tcm发生器(北京原子高科股份有限公司生产)、人宫颈癌Hela细胞株(泸州医学院附属医院中心实验室提供)等;(3)主要实验仪器为Mini-Scan TLC Scanner薄层放射性扫描仪(美国BIOSCAN公司生产)、CRC-15R活度计(美国 Capintec公司生产)、AB204-S电子分析天平(瑞士梅特勒公司生产)、DL-6M大容量低速冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司生产)、隔水式电热恒温培养箱(上海医疗器械七厂生产)、TC23233二氧化碳培养箱(美国SHELLAB生产)、超净操作台(苏州安泰空气技术有限公司生产)等。

1.2 方法

1.2.199Tcm-Gd-DTPA-DG的标记 (1)反应介质p H值对放化纯度和标记率的影响:取8个洁净的西林瓶,每瓶中依次加入10 mg Gd-DTPA-DG、0.6 mg SnCl2◦2H2O,然后分别用0.1 mmol/L HCl及0.1 mmol/L NaOH调节各反应液的p H值为 1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0,控制溶液体积为 2 mL,再加入0.2 mL Na99TcmO4洗脱液(37 MBq),沸水反应30 min即得99Tcm-Gd-DTPA-DG,测定其放化纯度和标记率;(2)还原剂SnCl2◦2H2O的用量对放化纯度和标记率的影响:取6个洁净的西林瓶,每瓶加入10 mg Gd-DTPA-DG,然后分别加入 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mg 的 SnCl2◦2H2O,用 0.1 mmol/L HCl调节pH值为2.0,控制溶液为2 mL,再加入0.2 mL Na99TcmO4洗脱液(37 MBq),沸水反应30 min即得99Tcm-Gd-DTPA-DG,测定其放化纯度和标记率;(3)反应温度对放化纯度和标记率的影响:取8个洁净的西林瓶,每瓶中加入10 mg的Gd-DTPA-DG,然后分别加入0.6 mg SnCl2◦2H2O、0.1 mmol/L HCl调节p H值为2.0,控制溶液为2 mL,再加入0.2 mL Na99TcmO4洗脱液(37 MBq),分别于 30、40、50、60、70、80、90、100 ℃反应30 min即得99Tcm-Gd-DTPA-DG,放化纯度和标记率。

1.2.299Tcm-Gd-DTPA-DG标记率的测定 采用薄层纸层析法(TLC),新华1号(1 cm×20 cm)层析纸为支持物,距离下缘1 cm处用毛细管点样,自然晾干后分别以生理盐水和丙酮为展开剂,在层析缸中上行展开10 cm后,终止,晾干,按照操作说明书在薄层放射性扫描仪上测定标记率。

1.2.399Tcm-Gd-DTPA-DG的体外稳定性 将新制备的99Tcm-Gd-DTPA-DG置于室温下,不同时间取样分析,测定99Tcm-Gd-DTPA-DG在室温下的存放稳定性,以便为临床用药提供指导,由于99Tcm的半衰期为6 h,故只测定反应后6 h内的稳定性。

1.2.4 小鼠体内分布 取昆明小鼠30只,随机分成6组,每组5只。经尾静脉注射0.1 mL约1.85 MBq99Tcm-Gd-DTPA-DG 后,于 10、30 min及1、2、4、24 h断头处死小鼠。取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、骨、血液,称重后用γ计数仪测定放射性计数,并计算每克脏器的放射性计数占注入剂量的百分数(%ID/g)。

2 结 果

2.1 标记反应的条件优化 当Gd-DTPA-DG用量为10 mg时,保持SnCl2◦2H2O用量及其他因素不变,放化纯度和标记率在温度为70℃以上时逐渐增高,达85%以上;至90℃时反应达高峰,在90～100℃时反应变化不大,最高可达98.5%(图1)。随着SnCl2◦2H2O用量的增加,99Tcm-Gd-DTPA-DG的放化纯度和标记率迅速增加。SnCl2◦2H2O用量在0.4～0.6 mg时,99Tcm-Gd-DTPA-DG的放化纯度和标记率略有上升,当SnCl2◦2H2O用量达到0.6mg时,99Tcm-Gd-DTPA-DG的放化纯度和标记率已达到98%以上(图 2)。当SnCl2◦2H2O用量超过0.7 mg或低于0.3 mg时,99Tcm-Gd-DTPADG的放化纯和标记率开始下降。本实验中,采用的SnCl2◦2H2O用量为0.6 mg。反应体系在太酸和中性及碱性溶液中放化纯及标记率不高,尤其在pH＞7时,已降到42%以下,pH＜5～＞1.5时,反应体系放化纯度及标记率逐渐增加,在p H为1.5～2.0时达最高值(95.5%),见图3。

图1 不同反应温度对99 Tcm-Gd-DTPA-DG标记率的影响

图2 不同SnCl2◦ 2H 2 O用量对99 Tcm-Gd-DTPA-DG标记率的影响

图3 不同pH值对99 Tcm-Gd-DTPA-DG标记率的影响

2.299Tcm-Gd-DTPA-DG放化纯度及稳定性 在丙酮展开体系中,99Tcm-Gd-DTPA-DG和水解还原99TcmO2的Rf为0～0.1,游离99TcmO4的 Rf为 0.9～1.0;在生理盐水展开体系中,99Tcm-Gd-DTPA-DG 和游离99TcmO4的 Rf为0.9～1.0,水解还原99TcmO2的 Rf为0～0.1。据此计算得99Tcm-Gd-DTPA-DG的放化纯度大于98%。标记物在室温放置6 h,放化纯度大于96%。

2.399Tcm-Gd-DTPA-DG在荷瘤裸鼠体内的分布 注射99Tcm-Gd-DTPA-DG从10 min到2 h内均显示出较高的肿瘤摄取,分别达(6.53±1.45)、(3.51±0.86)、(2.58±0.56)、(1.48±0.12)%ID/g(表1)。肾脏中的放射性较高,而肝脏、脾脏及小肠中放射性摄取不高,这可能是由于99Tcm-Gd-DTPA-DG是非胶体显像剂,其主要排泄途径是经泌尿系统排出体外。脑组织中放射性分布最低,最高仅为(0.36±0.07)%ID/g,其他各脏器的放射性摄取值随着时间的推移逐渐减小,在给药24 h后几乎已经接近本底;而肿瘤中的放射性摄取值从30 min至4 h均明显高于血液、肺脏、肌肉、脑等组织,在注射2 h后,肿瘤与肌肉的放射性摄取比(T/NT)最高,达2.91,表明99Tcm-Gd-DTPA-DG的肿瘤靶向性较好。

表1 99 Tcm-Gd-DTPA-DG在荷瘤裸鼠体内的生物分布(±s,%ID/g,n=5)

表1 99 Tcm-Gd-DTPA-DG在荷瘤裸鼠体内的生物分布(±s,%ID/g,n=5)

组织 10 min 30 min 1 h 2 h 4 h 24 h血液 10.61±4.28 2.52±0.12 1.93±0.39 1.20±0.15 0.49±0.05 0.30±0.02心脏 2.72±0.22 0.63±0.06 0.67±0.02 0.94±0.03 0.21±0.02 0.16±0.01脑0.36±0.07 0.20±0.01 0.16±0.02 0.14±0.01 0.04±0.01 0.03±0.01肺脏 6.29±23.7 1.75±0.28 1.47±0.37 1.46±0.60 0.40±0.02 0.17±0.02肾脏 16.01±6.17 11.27±2.35 9.32±2.27 3.54±1.76 2.61±0.68 0.42±0.21脾脏 2.25±0.14 1.10±0.34 0.94±0.31 0.86±0.24 0.33±0.04 0.20±0.02肝脏 3.01±0.52 1.04±0.21 1.01±0.34 1.41±0.37 0.74±0.03 0.36±0.03肌肉 4.86±1.51 2.59±0.45 1.20±0.11 0.51±0.08 0.36±0.02 0.24±0.08小肠 1.96±0.19 0.96±0.04 0.97±0.08 0.67±0.05 0.34±0.05 0.12±0.12肿瘤 6.53±1.45 3.51±0.86 2.58±0.56 1.48±0.12 0.63±0.08 0.29±0.06

3 讨 论

99Tcm标记Gd-DTPA-DG简便易得,标记率高,稳定性好。裸鼠体内分布实验表明其具有良好的肿瘤靶向性。SnCl2◦2H2O还原标记中,SnCl2◦2H2O起着很重要的作用,SnCl2◦2H2O过少,影响还原99TcmO4-的能力,使游离的高锝酸增加,放化纯度和标记率偏低;SnCl2◦2H2O过多,则容易反应生成胶体,导致放化纯度和标记率降低。其原因可能与SnCl2◦2H 2 O在偏酸的体系中比较稳定及配体Gd-DTPA-DG本身偏碱性有关。结果显示,肾脏中的放射性较高,而肝脏、脾脏及小肠中放射性摄取不高,可能是由于99Tcm-Gd-DTPA-DG是非胶体显像剂,其主要排泄途径是经泌尿系统排出体外。这可能是由于Gd-DTPA-DG为水溶性分子,其相对分子质量较FDG大,不易通过血脑屏障。作为一种脱氧葡萄糖类顺磁性对比剂,Gd-DTPA-DG已在磁共振上显示出一定的肿瘤强化价值[12],99Tcm标记有望使其成为一种能同时应用于MRI和单光子发射计算机断层显像(SPECT)检查的双模式影像探针,将进一步提高肿瘤的诊断效率。

[1] Kennedy DC,Duguay DR,Tay LL,et al.SERS detection and boron delivery to cancer cells using carboranelabelled nanoparticles[J].Chem Commun(Camb),2009,28(44):6750-6752.

[2] Wadas TJ,Deng H,Sprague JE,et al.Targeting the alphavbeta 3 integrin for small-animal PET/CT of osteolytic bone metastases[J].J Nucl Med,2009,50(11):1873-1880.

[3] Medarova Z,Rashkovetsky L,Pantazopoulos P,et al.Multiparametric monitoring of tumor response to chemotherapy by noninvasiveimaging[J].Cancer Res,2009,69(3):1182-1189.

[4] Lee S,Chen X.Dual-modality probes for in vivo molecular imaging[J].Mol Imaging,2009,8(2):87-100.

[5] Lijowski M,Caruthers S,Hu G,et al.High sensitivity:high-resolution SPECT-CT/MR molecular imaging of angiogenesis in the Vx2 model[J].Invest Radiol,2009,44(1):15-22.

[6] Ogawa M,Regino CA,Seidel J,et al.Dual-modality molecular imaging using antibodies labeled with activatable fluorescence and a radionuclide for specific and quantitative targeted cancer detection[J].Bioconjug Chem,2009,20(11):2177-2184.

[7] Sampath L,Kwon S,Ke S,et al.Dual-labeled trastuzumab-based imaging agent for thedetection of human epidermal growth factor receptor 2 overexpression in breast cancer[J].J Nucl Med,2007,48(9):1501-1510.

[8] Liu S,Jia B,Qiao R,et al.A novel type of dual-modality molecular probe for MR and nuclear imaging of tumor:preparation,characterization and in vivo application[J].Mol Pharm,2009,6(4):1074-1082.

[9] Chen Y,Huang ZW,He L,et al.Synthesis and evaluation of a technetium-99m-labeled diethylenetriaminepentaacetate-deoxyglucose complex([99Tcm]-DTPA-DG)as a potential imaging modality for tumors[J].Appl Radiat Isot,2006,64(3):342-347.

[10]Chen Y,Xiong Q,Yang X,et al.Noninvasive scintigraphic detection of tumor with99Tcm-DTPA-deoxyglucose:an experimental study[J].Cancer Biother Radiopharm,2007,22(3):403-405.

[11]Liang J,Chen Y,Huang Z,et al.Early chemotherapy response evaluation in tumors by99Tcm-DTPA-DG[J].Cancer Biother Radiopharm,2008,23(3):363-370.

[12]黄占文,张伟,陈跃,等.磁共振对比剂Gd-DTPA-DG的制备及动物实验研究[J].重庆医学,2010,39(21):2866-2868.