纪朋艳，罗 速，姜艳霞
（1.吉林医药学院医学实验中心，吉林 132013；2.北华大学，吉林 132013）
蛹虫草又名北冬虫夏草、北虫草、蛹草等，与名贵中药冬虫夏草为同属真菌植物。《全国中草药汇编》记载:“蛹虫草（北虫草）的子实体及虫体也可作为冬虫夏草入药”［1］。由于冬虫夏草在自然条件下不能长期保存，加之近年来环境条件日益受到破坏和无限的人工采集，虫草资源越来越贫乏。而目前人工栽培蛹虫草已获成功［2－5］，因此，对其有效成分的研究、开发具有更深的意义。国内外关于蛹虫草提取物（RW）对结肠癌细胞的作用及机制鲜有报道。本研究通过体外实验初步探讨RW对人结肠癌细胞株SW111C的作用，为其作为一种抗癌药物或防癌保健药应用于临床提供一定的实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞 结肠癌细胞株SW111C购自吉林省肿瘤研究所。用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养于37℃、5%CO2的恒温培养箱中。
1.1.2 药物与试剂 RW（由北华大学崔新颖教授所赠）用无菌二甲基亚砜（DMSO）助溶，其中DMSO的浓度小于0.1%。DMEM（低糖）培养基购自GIBCO公司，四甲基耦氮唑蓝（MTT）购自 Genview公司，台盼蓝购自Sigma公司，凋亡DNA Ladder提取试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司。
1.1.3 仪器与设备 流式细胞仪（Beckman Coulter Epics XL）、二氧化碳培养箱（日本平泽制作所）、倒置显微镜（Olympus）、低温超速离心机（Eppendorf 5417R型）、酶联免疫检测仪（南京华标仪器厂）等。
1.2 实验方法
1.2.1 MTT法观察RW对SW111C细胞增殖的抑制作用细胞以每孔5×103个，体积200μL接种于96孔板，37℃、5%CO2温箱内培养24h。吸弃培养液，实验组分别用浓度为2、4、8、16、32mg／L的RW 药液200μL处理；阴性对照组加入完全培养液200μL；调零组加入完全培养液200μL；各设复孔3个。注意在细胞加药后的第2天进行1／2的换液或换药，分别培养细胞24、48、72h后，每天取一块板，吸弃培养液，加入浓度为5g／L的MTT，20μL／孔。继续孵育4h后吸出各孔上清液，加入DMSO 150μL／孔，振荡10min。酶标仪以570nm为检测波长测定各孔光密度值（A值）。细胞增殖的抑制率＝（对照组A值－用药组A值）／对照组A值×100%。
1.2.2 台盼蓝拒染法检测RW对肿瘤细胞的杀伤作用 培养细胞、药物处理同MTT法，各设复孔3个。分别在48、72h后各取一块板，对细胞进行常规消化，制备单细胞悬液。悬液均匀后，立即向一青霉素小瓶中滴入细胞悬液9滴，再滴入台盼蓝染液1滴，混匀，放置3～5min。在15min内用血细胞计数板计数200个细胞。活细胞率＝未染色细胞数／细胞总数×100%，对照组活细胞率应在90%以上。
1.2.3 琼脂糖（DNA）凝胶电泳检测细胞凋亡 取对数生长期SW111C细胞以8×104个／mL接种于25mL培养瓶，每瓶2mL。细胞培养过夜，阴性对照组加入相应体积的完全培养液。实验组分别加入2、8、32mg／L的药液，每浓度组3瓶。药物加入72h后进行消化收集细胞。按照DNA Ladder抽提试剂盒说明书进行操作。将获得的DNA应用20g／L DNA凝胶电泳。电泳完成后取出凝胶于紫外透射仪下观察并照相。
1.2.4 流式细胞术（FCM）PI染色法检测细胞凋亡率及细胞周期变化 取对数生长期的细胞以8×104个／mL接种于12孔培养板内，每孔1mL。细胞培养过夜，阴性对照组加入相应体积的完全培养液。实验组分别加入2、8、32mg／L的药液，每个浓度加3瓶。药物作用72h后收获离心，磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗后再离心，70%的冷乙醇固定，4℃冰箱保存过夜。弃去70%的乙醇，用PBS漂洗后以100目筛网过滤，再离心（1000r／min，5min），弃PBS。加入PI工作液0.5mL，室温避光30min，上机检测。使用MultiCycle软件分析结果。
1.3 统计学处理 采用SPSS11.5统计分析软件，计量资料用表示。两组均数间比较采用t检验，多组均数比较采用单因素方差分析，对抑制率与RW浓度与作用时间进行直线相关回归分析。
2 结 果
2.1 MTT实验结果 结果显示RW对体外培养的SW111C细胞的生长具有抑制作用，随着RW浓度的升高和时间的增长，其细胞增殖的抑制率明显增加（表1）。
表1 RW对SW111C细胞抑制率的影响（，n＝3）
表1 RW对SW111C细胞抑制率的影响（，n＝3）
△:P＜0.05，＊:P＜0.01，与对照组同时间点比较。
组别抑制率（%）24h 48h 72h对照组000 RW 组（mg／L）2 2.95±1.376.96±1.6311.50±4.30＊4 3.80±1.8612.37±1.61△ 17.24±2.78＊8 8.43±1.2126.03±3.40＊ 30.11±3.52＊16 12.24±2.00△ 36.86±2.34＊ 41.30±4.72＊32 19.41±2.25＊ 45.62±1.85＊ 54.61±25.12＊
直线相关回归分析表明，RW对SW111C细胞增殖的抑制作用具有剂量、时间依赖效应。处理24、48、72h的IC50值分别为77.78、32.19、26.20mg／L。
2.2 台盼蓝拒染法检测结果 经RW作用48、72h后，随着浓度的增大，SW111C细胞存活率逐渐降低（图1）。
2.3 DNA凝胶电泳结果 RW作用72h后DNA抽提DNA凝胶电泳结果显示，2.8mg／L RW组处理的SW111C细胞的DNA凝胶电泳图谱未出现明显可辨的“梯状”条带，32mg／L RW组的电泳图谱出现“梯状”条带（图2）。
图1 RW对SW111C细胞存活率的影响
图2 RW作用后细胞DNA凝胶电泳结果
表2 不同浓度的RW对SW111C细胞周期的影响（，n＝3）
表2 不同浓度的RW对SW111C细胞周期的影响（，n＝3）
＊:P＜0.01，与对照组比较。
组别细胞周期G1 S G2对照组56.7±2.5721.2±3.6322.1±3.06 RW 组（mg／L）2 63.2±1.33＊ 18.3±3.3218.5±2.518 65.7±2.48＊ 13.7±3.32＊ 20.6±2.2332 76.1±2.93＊ 11.5±2.84＊ 12.4±3.51＊
2.4 FCM检测细胞周期和凋亡率的结果 RW作用72h后，SW111C细胞周期和凋亡率都发生了明显的变化。随着RW浓度的提高和作用时间的延长，G1期细胞明显增多，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；S期细胞明显减少，8、32 mg／L RW组与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；G2期细胞减少，但不明显。说明细胞大多阻滞于G1期，并呈一定的浓度依赖性（表2）。FCM结果显示RW作用后都发现了位于G1期前的亚G1峰，凋亡率均明显高于对照组，差异有统计学意义，且凋亡率呈浓度相关性（表3）。
表3 不同浓度的RW对SW111C细胞凋亡率的影响（，n＝3）
表3 不同浓度的RW对SW111C细胞凋亡率的影响（，n＝3）
＊:P＜0.01，与对照组比较。
组别凋亡率（%）对照组1.9±1.3 RW 组（mg／L）26.8±2.32＊8 11.8±2.58＊32 16.9±1.93＊
3 讨 论
蛹虫草中含有多种抗肿瘤活性成分，虫草素、虫草酸、虫草多糖、麦角甾醇、超氧化物歧化酶、硒等，并且可单独或共同发挥抗肿瘤作用［6－11］。本研究中的RW是从蛹虫草提取出的活性成分。MTT法和台盼蓝拒染法检测结果显示RW在2～32 mg／L的浓度范围内对SW111C细胞增殖有不同程度抑制，抑制率与RW浓度和作用时间呈依赖关系。恶性肿瘤不仅是细胞增殖和分化异常的疾病，也是细胞凋亡异常的疾病［12］，细胞凋亡的减少可引起肿瘤的发生且通过逃避凋亡而促进肿瘤细胞的恶性转化及演进［13］。因此，抗癌药物的疗效不仅取决于药物与各自靶点的相互作用，也取决于药物诱导细胞发生程序性死亡的能力［14］。本实验中DNA凝胶电泳及FCM检测结果显示，RW可引起SW111C细胞的凋亡，且凋亡率呈浓度相关性，与MTT法测得的对增殖的抑制相一致。
本研究发现RW作用72h后可使SW111C细胞受阻于G1期，导致S期细胞降低。而肿瘤细胞增殖的快慢，主要取决于细胞G0／G1期的长短，G0／G1期短，肿瘤细胞增殖快，处于G0／G1期的细胞数少［15］，故RW对SW111C细G1期阻滞可能使细胞生长周期延长，细胞的恶性增殖减慢。
综上所述，RW对结肠癌细胞SW111C的生长具有明显抑制作用，且这种抑制作用呈时间剂量依赖方式。这种对增殖的抑制作用与诱导SW111C细胞凋亡、改变其细胞周期分布有关。但RW由哪些物质组成、具体哪些成分起作用等问题尚待进一步研究；另一方面，更要进行动物实验及临床研究，开发出低毒、高效能的蛹虫草提取物，为人类结肠癌的防治开拓新的途径。
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