彭 力，钟礼立，黄 寒，厉 娟，梁 沫，李 云

（湖南省人民医院儿科，长沙410005）

婴幼儿喘息是小儿呼吸道疾病的一种常见症状，有反复发作倾向，其中30%～50%患儿可发展成哮喘。而判断哪些婴幼儿喘息最终会发展为哮喘，需要早期干预治疗仍然是目前喘息性疾病防治的一个难点。CD4＋CD25＋调节性T细胞（regulatory T cells，Treg），具有低反应性和免疫抑制两大功能特性，但具有免疫调节或抑制活性的细胞主要是高表达CD25＋的CD4＋T细胞（CD4＋CD25higTreg）。人转录因子Foxp3是Treg分化发育的关键基因，主要表达于CD4＋CD25higTreg。Treg在儿童支气管哮喘和过敏性疾病的发病中表达是下调的，但在婴幼儿喘息中的表达研究甚少。本研究试图通过对首次喘息婴幼儿CD4＋CD25＋Treg、CD4＋CD25higTreg及叉头／翼状螺旋转录因子（Foxp3）mRNA表达的研究，探讨有特应征和非特应征喘息婴幼儿CD4＋CD25＋Treg、CD4＋CD25higTreg及Foxp3mRNA表达变化及与IgE的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择本院2010年10月至2011年1月因喘息性疾病住院的婴幼儿（首次发作）55例，两肺听诊有喘鸣音，其中4例（后来经胸部CT、纤维支气管镜检查有支气管软化2例、呼吸道异物2例）除外，共51例患儿，其中男36例，女15例；年龄1个月至3岁（中位年龄8个月）。其中特应征组28例，男22例，女6例；有湿疹、过敏性鼻炎等特应征及特应征家族史。非特应征喘息组23例，男14例，女9例；无湿疹、过敏性鼻炎等特应征及特应征家族史。对照组20例，为门诊健康体检者，无家族过敏史及近期无呼吸道感染婴幼儿。采血前2周均未用过糖皮质激素、抗组胺药及免疫调节剂。

1.2 方法

1.2.1 CD4＋CD25＋Treg和CD4＋CD25higTreg测定 CD4＋CD25＋Treg和CD4＋CD25higTreg的测定分别采集喘息婴幼儿及健康患儿外周静脉血2mL，肝素抗凝；取肝素抗凝的全血100μL，加入CD4－PE和 CD25－FITC单克隆抗体20μL，IgG1－PE和IgG1－FITC作为同型对照，室温闭光反应30min；加2mL溶血剂在室温下溶解红细胞约10min，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤，离心 5min（1 500r／min），弃上清；每份标本加入1%多聚甲醛500μL后用流式细胞仪检测。流式细胞仪为Beckman－CoulterXL100（Coulter公司产品）。

1.2.2 RT－PCR检测 PBMCsFoxp3mRNA 的表达 分离外周血中单个核淋巴细胞，用PBS洗涤2次，加入Trizol提取细胞总RNA，经紫外线分光光度法定量后，取5μgRNA在寡聚脱氧胸苷酸（oligo－dT）和Moloney鼠白血病病毒逆转录酶（MMLV）存在的情况下进行逆转录反应合成互补DNA（cDNA），以cDNA为模板进行PCR扩增。引物序列为：Foxp3（176bp）正义5′－CAG CAC ATT CCC AGA GTT CCT C－3′，反义5′－GCG TGT GAA CCA GTG GTA GAT C－3′，内参基因三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）（598bp）正义5′－CCA CCC ATG GCA AAT I′CC ATG GCA－3′，反义5′－TCT AGA CGG CAG GTC AGG TCC ACC－3′。反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，60℃退火2min，72℃延伸2min，32个循环后PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳。电泳图像用英国UVP公司GDS8000型全自动图像分析系统处理，以同一标本的Foxp3与内参照GAPDH扩增条带的光密度比值。

1.2.3 血清总IgE水平测定 取另外2mL外周血，取血清用瑞典玛西亚公司UniCAP变应原检测系统酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清总IgE水平。

2 结 果

2.1 喘息组和对照组 CD4＋CD25＋Treg、CD4＋CD25higTreg百分率及Foxp3mRNA比较 喘息患者外周血CD4＋CD25＋Treg和CD4＋CD25higTreg细胞占CD4＋T细胞的百分比及Foxp3mRNA均明显低于健康对照组。性别、年龄与CD4＋CD25＋Treg、CD4＋CD25higTreg及Foxp3mRNA表达不相关。见表1和图1。

表1 喘息组和对照组CD4＋CD25＋、CD4＋CD25hig Treg百分率及Foxp3mRNA比较（±s）

表1 喘息组和对照组CD4＋CD25＋、CD4＋CD25hig Treg百分率及Foxp3mRNA比较（±s）

＊：P＜0.01，与对照组比较。

组别 nCD4＋CD25＋Treg（%）CD4＋CD25higTreg（%）Foxp3m RNA／GAPDH喘息组 51 6.31＋2.96＊ 3.52＋1.46＊ 0.27＋0.11＊对照组20 9.28＋2.40 4.81＋1.50 0.39＋0.19

表2 两组CD4＋CD25＋、CD4＋CD25higTreg百分率及Foxp3mRNA与总IgE比较（±s）

表2 两组CD4＋CD25＋、CD4＋CD25higTreg百分率及Foxp3mRNA与总IgE比较（±s）

＊：P＜0.05，＊＊：P＜0.01，与非特应征喘息组比较。

组别 n CD4＋CD25＋Treg（%） CD4＋CD25higTreg（%） Foxp3mRNA／GAPDH 总IgE特应征喘息组 28 4.66＋1.17＊ 2.50＋0.52＊ 0.24＋0.13＊ 102.00＋47.43＊＊非特应征喘息组 23 7.96＋3.33 4.56＋2.01 0.30＋0.08 26.85＋15.30

图1 喘息婴幼儿外周血Treg Foxp3mRNA和参比基因电泳图

2.2 特应征喘息与非特应征喘息婴幼儿CD4＋CD25＋Treg、CD4＋CD25higTreg百分率及Foxp3mRNA、IgE比较 特应征喘息组外周血CD4＋CD25＋Treg、CD4＋CD25higTreg比率及Foxp3mRNA均明显低于非特应征喘息组，而总IgE较非特应征喘息组高，且各组差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2和图2、3。

2.3 CD4＋CD25＋Treg、CD4＋CD25higTreg百分率及 Foxp3 mRNA与总IgE相关分析 CD4＋CD25higTreg及Foxp3mR－NA与总IgE相关分析呈负相关（r＝－0.75，r＝－0.61，P＜0.01）；而该组CD4＋CD25＋Treg与总IgE相关分析呈正相关（r＝0.36，P＜0.05）。

图2 特应征喘息组和非特应征喘息组CD4＋CD25＋Treg占CD4＋T细胞的比率与对照组比较

图3 特应征喘息组和非特应征喘息组CD4＋CD25higTreg占CD4＋T细胞的比率与对照组比较

3 讨 论

Sakaguchi［1］于1995年首先描述 CD4＋CD25＋Treg是一个有免疫抑制特性的T细胞群，在应答单克隆抗－CD3或抗原刺激不会增殖，且能够抑制CD4＋CD25－T细胞的增殖应答，占未免疫的小鼠和健康人外周CD4＋T细胞总数的5%～10%。根据CD4＋T细胞表达CD25的程度不同，CD4＋CD25＋Treg又可分为CD4＋CD25higTreg和CD4＋CD25lowTreg，在小鼠中，两类细胞都有免疫活性，而有人认为在外周血中起免疫活性的是前者［2］。Foxp3是鉴别Treg的一个特异性标志物［3－4］，也是CD4＋CD25＋Treg发展和功能维持的关键转录因子。Foxp3基因缺失使CD4＋CD25＋Treg抑制活性消失，而Foxp3在CD25－Treg异位表达则可恢复抑制活性［3－5］。目前研究表明，Foxp3主要表达于CD4＋CD25higTreg，达97%左右［6］。人Foxp3基因突变表现为IPEX（免疫失调、多内分泌腺病、肠病、X连锁综合征），包括上升的IgE应答和变应性皮炎［7－8］。

目前研究显示支气管哮喘是Th2介导的以气道高反应、可逆的气流受阻、气道嗜酸粒细胞侵润、气道黏液高分泌及血清高IgE为特征的气道慢性炎症性疾病。目前一般认为，哮喘患者体内存在有Th1／Th2平衡改变，Th1细胞受到抑制，而Th2细胞异常活化，通过分泌IL－4、IL－5、IL－13等细胞因子促进B细胞合成IgE分子，刺激内皮细胞表达更多黏附分子，使炎性细胞向病变局部浸润。随研究深入，Treg可能在支气管哮喘和其他过敏性疾病中也起重要作用。长期暴露在哮喘发生时CD4＋Treg向Th2细胞偏移是因为Treg未形成，减少Treg数量或削弱Treg功能都可能导致哮喘的发生［9］。Hartl等［10］则认为，哮喘儿童肺泡灌洗液中CD4＋CD25higTreg值是下降的，其吸入糖皮质激素与外周血和肺泡灌洗液CD4＋CD25higT细胞比例上升相关。同样有研究表明，与对照组相比，哮喘儿童 CD4＋CD25＋Treg细胞、IL－10分泌型 CD4＋CD25＋Treg及 TGF－β分泌型CD4＋CD25＋Treg、Foxp3mRNA的数目是下降的，CD4＋CD25＋Treg下降可能与哮喘发病机制相关［11］。

婴幼儿喘息多有反复发作的可能，它的发病机制目前仍不十分清楚，与特应性体质、环境因素等有关，与哮喘可能存在相似的免疫学发病机制［12］。婴幼儿哮喘早期即存在气道炎症反应和气道重塑，而早期干预可防止肺功能长期、不可逆的损害。如何在喘息发作初期发现潜在的哮喘患儿成为当今研究的关键。本实验结果显示，喘息婴幼儿CD4＋CD25＋Treg、CD4＋CD25higTreg百分率及外周血Foxp3的表达明显低于对照组，Treg及Foxp3可能在婴幼儿喘息的疾病活动中起重要作用，可能参与婴幼儿喘息的发病机制。

特应征是由IgE介导的，以Th2占优势的免疫应答所表达。特应征个体针对致敏原的Th2应答而非特应征个体不会，目前一个可能的解释是Treg的影响，其有助于提高对变应原和其他炎症刺激的免疫耐受［13］。本研究显示，喘息特应征组CD4＋CD25＋Treg、CD4＋CD25higTreg比非特应征组显着降低，与朱亚飞等［14］研究报道呼吸道合胞病毒感染毛细支气管炎特应征喘息组CD4＋CD25＋Treg比非特应征组降低一致，表明变应原特异的Treg在婴幼儿变应性喘息个体是有缺陷的。另外，本实验发现喘息特应征组CD4＋CD25higTreg与总IgE呈负相关，为此他推测CD4＋CD25higTreg参与婴幼儿变应性喘息的发生发展过程，外周血下降的CD4＋CD25higTreg数目导致免疫抑制功能下降，从而导致Th2细胞大量增殖活化，IgE抗体分泌增加，产生大量致炎因子从而引起喘息发作，外周血CD4＋CD25higTreg比例可能是一个较好反映细胞免疫功能的参考指标，有可能对首次喘息婴幼儿预后的早期预测有重要价值，今后有必要增加病例数及进行进一步随访和相关研究。而有趣的是，作者同时发现特应征喘息组CD4＋CD25＋Treg与总IgE呈正相关，这表明CD4＋CD25＋Treg有可能与特应征状态相关，在变应原暴露和随后的Treg激活下表达增加。已有报道在特应性皮炎个体，具有正常的抑制活性的CD4＋CD25＋Treg有正常的或相对高的数值［15－16］；哮喘个体，在急性加重期CD4＋CD25＋Treg是显着增加的［17－18］。作者这部分研究与该两篇报道存在相似性。Lee等［19］认为，来自相对严重特应征表型的个体，其CD4＋CD25＋Treg升高有可能代表在过敏性疾病加重时，作为一种免疫应答产生的诱导的或适应性T调节细胞。作者的进一步研究将对这些Treg进行更深入的认识，识别哪些部分Treg是真正的效应性T调节细胞。此外，本实验与朱亚飞等［14］报道呼吸道合胞病毒感染毛细支气管炎CD4＋CD25＋Treg与总IgE呈负相关不一致，可能原因为本实验为首次喘息患儿，发病机制与呼吸道合胞病毒这种单一特殊病毒感染并非完全一致。同样作者发现，Foxp3的表达也与IgE呈负相关，因此推测在婴幼儿喘息的发病中可能存在Foxp3基因表达降低而导致Treg主要是CD4＋CD25higTreg下降而不能发挥正常的免疫抑制功能，而诱导Foxp3基因表达增加，进而诱导Treg增加是治疗婴幼儿喘息的重要机制之一。

综上所述，喘息婴幼儿有下降的CD4＋CD25＋Treg、CD4＋CD25higTreg及Foxp3表达，特应征组更为显着，表明下降的Treg有可能代表喘息婴幼儿尤其是特应征喘息儿的一种缺陷。

［1］ Sakaguchi S.Naturally arising Foxp3－expressing CD4＋CD25＋T regulatory T cells in immunological tolerance to self and non－self［J］.Nat Immunol，2005，6（4）：345－352.

［2］ Baecher－Allan C，Brown JA，Freeman GJ，et al.CD4＋CD25higregulatory cells in human peripheral blood［J］.J Immunol，2001，167（3）：1245－1253.

［3］ Hori S，Nomura T，Sakaguchi S.Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3［J］.Science，2003，299（5609）：1057－1061.

［4］ Fontenot JD，Rudensky AY.A well adapted regulatory contrivance：regulatory T cell development and the forkhead family transcription factor Foxp3［J］.Nat Immunol，2005，6（4）：331－337.

［5］ Fontenot JD，Gavin MA，Rudensky AY.Foxp3programs the development and function of CD4＋CD25＋regulatory T cells［J］.Nat Immunol，2003，4（4）：330－336.

［6］ 焦志军，尤海燕，陈蕾，等.流式细胞术检测表达Foxp3的CD4＋CD25＋Treg［J］.临床检验杂志，2008，26（3）：161－163.

［7］ Wildin RS，Freitas A.IPEX and FOXP3：clinical and research perspectives［J］.J Autoimmunity，2005，25Suppl：56－62.

［8］ Wildin RS，Smyk－Pearson S，Filipovich AH.Clinical and molecular features of the immunodysregulation，polyendocrinopathy，enteropathy，X linked（IPEX）syndrome［J］.J Med Genet，2002，39（8）：537－545.

［9］ Umetsu DT，DeKruyff RH.The regulation of allergy and asthma［J］.Immunol Rev，2006（212）：238－255.

［10］Hartl D，Koller B，Mehlhorn AT，et al.Quantitative and functional impairment of pulmonary CD4＋CD25hi regulatory T cells in pediatric asthma［J］.J Allergy Clin Immunol，2007，119（5）：1258－1266.

［11］Zu Y，Li CR，Zheng YJ，et al.The role of CD4＋CD25＋regulatory T cells in the pathogenesis of asthma in children［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2006，86（1）：35－38.

［12］Legg JP，Hussain LR，Warner JA，et al.Type 1and type2cytokines imbalance in acute respiratory syncytial virus bronchiolitis［J］.AmJ Respir Crit Med，2003，168（6）：633－639.

［13］Tournoy KG，Hove C，Grooten J，et al.Animal models of allergen－induced tolerance in asthma：are T－regulatory－Tcells（Tr1）the solution for T－helper－2cells（Th－2）in asthma［J］.Clin Exp Allergy，2006，36（1）：8－20.

［14］朱亚非，朱建央，李卫武，等.毛细支气管炎CD4＋CD25＋Treg和Foxp3mRNA表达及与IgE关系［J］.中国当代儿科杂志，2009，11（5）：349－353.

［15］Ou LS，Goleva E，Hall C，et al.T regulatory cells in atopic dermatitis and subversion of their activity by superantigens［J］.J Allergy Clin Immunol，2004，113（4）：756－763.

［16］Vukmanovic－Stejic M，McQuaid A，Birch KE，et al.Relative impact of CD4＋CD25＋regulatory T cells and tacrolimus on inhibition of T－cell proliferation in patients with atopic dermatitis［J］.Br J Dermatol，2005，153（4）：750－757.

［17］Gemou－Engesaeth V，Bush A，Kay AB，et al.Inhaled glucocorticoid therapy of childhood asthma is associated with reduced peripheral blood T cell activation and"Th2－type"cytokine mRNA expression［J］.Pediatr，1997，99（5）：695－703.

［18］Shi HZ，Li S，Xie ZF，et al.Regulatory CD4＋CD25＋T lymphocytes in peripheral blood from patients with atopic asthma［J］.Clin Immunol，2004，113（2）：172－178.

［19］Lee JH，Yu HH，Wang LC，et al.The levels of CD4＋CD25＋regulatory T cells in paediatric patients with allergic rhinitis and bronchial asthma［J］.Clin Exp Immunol，2007，148（1）：53－63.