羧甲司坦对慢性气道炎症大鼠肺组织中PI3K／AKT和γ－GCS表达的影响

李国吾，夏熙郑，刘待见

（郑州大学第二附属医院呼吸内科，郑州450014）

氧化－抗氧化失衡是慢性气道炎症的主要发病机制之一［1］。谷胱甘肽（glutathione，GSH）是体内重要的抗氧化剂，在保护气道上皮细胞完整性、抵御肺部损伤与抗炎等方面发挥重要的作用［2］。γ－谷氨酰半胱 氨酸合 酶（γ－glutamylcysteine synthetase，γ－GCS）是GSH合成的限速酶，对GSH生成的速度和量具有调控作用［3］。最新发现磷脂酰肌醇－3－激酶（phosphatidylinositol－3－kinase，PI3K）／蛋白激酶 B（protein kinaseB，AKT）通路可能调控γ－GCS的表达［4］。羧甲司坦是经典的黏痰溶解剂，最新的体外研究证实其具有抗氧化作用，但其具体的作用机制尚不清楚［5］。本实验旨在探讨羧甲司坦对PI3K／AKT通路及γ－GCS表达的影响，研究其抗氧化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 羧甲司坦片为广州白云山制药股份有限公司产品，脂多糖试剂购自美国Sigma公司，还原型GSH测试盒购自南京建成生物工程研究所，兔抗磷酸化AKT（phosphorylated AKT，p－AKT）、γ－GCS多克隆抗体为美国Santa cruz公司产品，通用型SP系列工作液试剂盒（SP－9000）购自北京中杉生物工程公司，逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptasepolymerase chain reaction，RT－PCR）测试盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。

1.2 实验动物分组及模型制备 清洁级雄性Sprague－Dawley（SD）大鼠30只（郑州大学实验动物中心），平均体质量（190.0±10.0）g，按随机数字表法分为3组，每组10只。本实验采用国内通用方法［6］：（1）模型组：第1、16天，大鼠用10%水合氯醛3mL／kg腹腔注射麻醉后，将脂多糖（1mg／mL）200μL注入气管内；在第2～15天、第17～30天将大鼠置入自制密闭箱内被动吸红旗渠牌香烟（每支含尼古丁1mg，焦油10mg），烟雾浓度约5%（v／v），每天2次，每次约1h；第17～30天上午吸烟前30min予生理盐水1.5mL灌胃。（2）羧甲司坦治疗组：脂多糖处理及烟熏同模型组；第17～30天上午吸烟前30min给予羧甲司坦500mg／kg灌胃。（3）对照组：正常饲养，第1、16天用10%水合氯醛3mL／kg腹腔注射麻醉，气管内注入生理盐水200μL，第17～30天给予生理盐水1.5mL灌胃。所有大鼠均在第31天用10%水合氯醛3mL／kg腹腔注射麻醉，颈动脉放血处死，行肺泡灌洗，留取实验标本。

1.3 实验方法

1.3.1 支气 管 肺 泡 灌 洗 液 （bronchoalveolar lavage fluid，BALF）的涂片计数 颈动脉放血处死大鼠，开胸分离出气管及肺组织，结扎右主支气管，在气管中上1／3环状软骨处离断，将静脉套管顺气管方向插至左侧肺门处并固定，用生理盐水3mL注入左肺，停顿30s后回抽，反复3次，BALF回收率约80%，将BALF行涂片细胞分类计数。

1.3.2 肺组织病理学观察及组织标本的保存 取左侧肺组织，用4%甲醛固定，石蜡包埋切片，苏木素－伊红染色后光学显微镜观察。切取右下肺，将其浸入4%多聚甲醛固定后用于免疫组织化学检测；其余右肺迅速置于液氮，－80℃保存，用于 GSH、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、总抗氧化能力（total antioxidative capability，T－AOC）和 RT－PCR检测。

1.3.3 肺组织p－AKT及γ－GCS的免疫组织化学检测 采用免疫组织化学链霉素抗生物素蛋白－过氧化物酶（streptavidinperosidase，SP）法检测p－AKT蛋白及γ－GCS蛋白的表达。取4%多聚甲醛固定的右下肺组织，石蜡包埋切片，脱蜡至水，抗原修复，加山羊血清封闭，先后加入第一、二抗体，二氨基联苯胺（3，3′－diaminobenzidine，DAB）显色，苏木素复染后脱水封片。细胞核出现棕黄或棕褐色为阳性。使用Biosens Digital Imaging System（V1.6）图像分析系统检测图像中阳性区平均积分光密度。

1.3.4 肺组织PI3 KmRNA及γ－GCS mRNA的 RT－PCR检测 将待检肺组织取出后在液氮下研磨，加入1mL Trizol试剂抽提RNA，RNA纯度、含量及完整性的检测和RT－PCR操作步骤均依照文献进行。PI3 KmRNA上游引物：5′－AGA TGA GGT GAG GAA CGA AGA A－3′，下游引 物：5′－AGG AGG AAG CGG TGG TCT A－3′，扩增片段为480bp；γ－GCS mRNA上游引物：5′－AGA TGA TAG AAC ACG GGA GG－3′，下游引物：5′－CAC AAA TAC CAC ATA GGC AGA－3′，扩增片段为424bp；β－actin上游引物为：5′－ATC ATG TTT GAG ACC TTC AAC A－3′，下游引物为：5′－CAT CTC TTG CTC GAA GTC TA－3′，扩增产物为318bp。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，置于暗箱式紫外透射仪中成像，软件分析计算灰度值。

1.3.5 肺组织GSH、ROS及T－AOC含量的检测 取右肺组织用比色法按试剂盒操作说明书测定GSH、ROS及T－AOC的含量。

1.4 统计学处理 采用SPSS17.0软件进行统计学分析，计量数据用±s表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠BALF中炎症细胞的表达 模型组大鼠BALF中细胞总数较对照组明显增多（P＜0.05），其中以中性粒细胞增多为主。羧甲司坦治疗组细胞总数较模型组明显降低（P＜0.05），但较对照组明显增多（P＜0.05）。见表1。

2.2 肺组织病理学改变 对照组大鼠气道上皮细胞完整，肺组织结构正常；模型组上皮细胞脱落、坏死严重，可见大量炎症细胞浸润；羧甲司坦治疗组上皮细胞脱落、坏死及炎症细胞浸润较模型组减轻。

2.3 肺组织中p－AKT蛋白及γ－GCS蛋白的表达 模型组大鼠肺组织中p－AKT蛋白及γ－GCS蛋白的表达明显高于羧甲司坦治疗组和对照组（P＜0.05），羧甲司坦治疗组大鼠肺组织中p－AKT蛋白及γ－GCS蛋白的表达明显高于对照组（P＜0.05）。见表2。

2.4 PI3 KmRNA及γ－GCS mRNA表达 RT－PCR显示，模型组PI3 KmRNA及γ－GCS mRNA表达明显高于羧甲司坦治疗组和对照组（P＜0.05），且羧甲司坦治疗组PI3 KmRNA及γ－GCS mRNA表达明显高于对照组（P＜0.05）。见图1、表2。

2.5 肺组织中GSH、ROS及T－AOC的含量 与对照组比较，模型组及羧甲司坦治疗组大鼠肺组织GSH及ROS含量均增加，ROS的增加尤为明显，而T－AOC含量显着降低（P＜0.05）。提示模型组和羧甲司坦治疗组的GSH的增加不足以抵抗ROS的增加，存在氧化－抗氧化失衡。见表3。

表1 各组大鼠BALF细胞总数及分类 （±s）

表1 各组大鼠BALF细胞总数及分类 （±s）

＊：P＜0.05，与对照组比较；＃：P＜0.05，与模型组比较。

组别 细胞总数（×105／mL） 细胞分类（%）单核－巨噬细胞 中性粒细胞 淋巴细胞对照组1.65±0.38 81.13±2.58 13.21±1.76 5.66±0.91模型组 7.32±0.77＊ 65.15±4.85＊ 30.43±4.54＊ 4.42±1.19＊羧甲司坦治疗组 4.20±0.61＊＃ 78.15±5.41＊＃ 16.14±3.94＊＃ 5.71±2.37＊＃

表2 各组大鼠肺组织p－AKT蛋白、γ－GCS蛋白、PI3 KmRNA及γ－GCS mRNA的表达

2.6 p－AKT与γ－GCS蛋白及γ－GCS mRNA的相关性 慢性气道炎症大鼠肺组织中p－AKT与γ－GCS蛋白及γ－GCS mRNA的表达均呈显着性正相关（r＝0.812，r＝0.741；P＜0.01）。

表3 各组大鼠肺组织GSH、ROS及T－AOC的含量

图1 大鼠肺组织PI3 KmRNA及γ－GCS mRNA的表达

3 讨 论

炎症和氧化－抗氧化失衡是慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary diseases，COPD）的重要的发病机制［7］。本实验显示，模型组BALF中细胞总数、中性粒细胞数明显增加，肺组织炎症细胞浸润明显，支气管黏膜排列紊乱；与对照组比较，模型组大鼠肺组织中GSH、ROS含量均增高，前者增高的程度低于后者；而T－AOC显着降低，表明模型组肺组织中存在炎症和氧化－抗氧化失衡。

本实验显示，模型组大鼠肺组织中p－AKT蛋白、γ－GCS蛋白、PI3 KmRNA及γ－GCS mRNA的表达水平均较对照组明显提高，提示慢性气道炎症大鼠肺组织中存在氧化应激反应，相关性分析显示p－AKT与γ－GCS蛋白及γ－GCS mRNA的表达呈正相关，说明PI3K／AKT的信号通路途径可能参与调节γ－GCS的表达。γ－GCS是GSH 合成的限速酶，γ－GCS的高表达促进GSH合成增加，从而参与局部抗氧化作用。Li等［8］在研究中发现PI3K的抑制剂LY294002能阻止GSH的上调。Arisawa等［9］研究证明P13K／AKT通路经过熊去氧胆酸活化后可促进红系衍生的核因子2相关因子2（nuclear factor erythroid 2－related factor 2，Nrf2）核转位，从而调控γ－GCS的表达。Martin等［10］也发现，PI3K可能激活一些有助于增加Nrf2蛋白水平的稳定蛋白的转录。实验结果提示PI3K／AKT信号通路通过增加Nrf2上游调控激酶的表达促进Nrf2核转位，从而提高γ－GCS的表达水平，进而增加GSH的合成。

羧甲司坦是经典的黏痰溶解药物，它可以裂解二硫键，改善痰的黏滞性［11］。最新研究表明，因其分子结构中含有较高的巯基（－SH），可能具有抗感染、抗氧化应激作用［12－13］。本实验通过早期应用羧甲司坦干预被动吸烟大鼠慢性气道炎症来观察其作用。羧甲司坦治疗组大鼠BALF中细胞总数较模型组有所降低，中性粒细胞数也显着减少。肺组织病理学检测显示，羧甲司坦治疗组支气管黏膜上皮结构排列混乱、中性粒细胞浸润均较模型组有所减轻，说明羧甲司坦治疗组气道炎症有所减轻。羧甲司坦治疗组的PI3 KmRNA、p－AKT蛋白及γ－GCS蛋白的表达水平均较模型组降低，GSH、ROS含量也较模型组有所降低，且ROS降低较为明显，T－AOC也显着升高，说明羧甲司坦治疗组氧化－抗氧化失衡有所改善。综上所述，提示羧甲司坦具有抗感染、抗氧化作用。Yasuda等［14］临床研究也表明羧甲司坦在抗氧化、减轻系统性炎症等方面发挥重要作用。国内22个多中心的PEACE临床研究表明羧甲司坦可使COPD急性发作率降低24.5%，其确切机制尚不清楚［12］。最新的体外研究证实羧甲司坦可通过清除ROS发挥抗氧化作用［15］。这与本实验结果一致，即羧甲司坦可减轻被动吸烟大鼠肺部的炎症和氧化应激。

总之，本研究表明PI3K／AKT信号通路可参与对抗氧化基因γ－GCS的调控，其可能机制为被动吸烟消耗抗氧化物GSH，造成氧化－抗氧化失衡，同时又激活PI3K／AKT信号通路，增加Nrf2上游的调控蛋白的表达，引起Nrf2核转位，后者与γ－GCS基因启动子上相应位点结合，启动γ－GCS mRNA的转录，提高γ－GCS的含量，从而增加GSH的合成，对抗氧化应激，改善氧化－抗氧化失衡。本实验进一步证明了羧甲司坦具有减轻炎症细胞浸润，清除ROS，发挥抗感染、抗氧化的作用，为羧甲司坦的临床应用提供了依据。

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