转录因子AP-2α对 HeLa细胞内14-3-3σ表达的影响＊

甘 露，黄明元，蒙子君，张 哲，罗炳德△

（1.南方医科大学公共卫生与热带医学学院预防医学实验教学中心，广州 510515；

2.广东医学院公共卫生学院劳动卫生与环境卫生教研室，广东东莞 523808）

14-3-3σ是14-3-3蛋白家族的一个成员，它可与多种蛋白结合，参与细胞信号转导、增殖和死亡调控及细胞的迁移运动等，在体内发挥重要的生物学功能，在肿瘤的发生、生长、演化过程中发挥重要作用。研究者发现14-3-3σ在正常皮肤的基底细胞高表达，在多种上皮来源的肿瘤中发挥了作用［1－2］。14-3-3σ基因受到包括P53在内的多种转录因子的直接调控，14-3-3σ蛋白反过来又能与P53等转录因子相螯合，影响转录因子发挥作用［3］。但直至目前，14-3-3σ是否与另一个转录因子激活蛋白（activator protein-2α，AP-2α）发生相互作用尚未见报道。因此，本研究对转录因子 AP-2α调控14-3-3σ的作用进行了探讨。

1 材料与方法

1.1 材料 真核表达载体pCMV-Myc购自Clontech公司，pGL3-Basic质粒购自Promega公司，pMD18-T载体、限制性内切酶、T4DNA连接酶、T4聚合酶购自NEB公司，Lipofectamine 2000转染试剂盒、Trizol试剂购自Invitrogen公司，化学合成的AP-2αsiRNA和siRNA control购自上海吉玛公司。

1.2 细胞培养和转染 人宫颈上皮细胞癌细胞系HeLa细胞由本实验室保存，在含10%胎牛血清的高糖型DMEM培养基中培养，培养条件为37℃、5%CO2，相对湿度95%。细胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA进行消化传代。细胞转染利用Invitrogen公司的Lipofectamine 2000试剂盒，按照试剂盒提供的实验方法进行转染。转染所用的质粒均由本实验室提供。

1.3 载体构建 为获得AP-2α过表达质粒，AP-2α全长编码序列由PCR扩增得到，T载体克隆后酶切连入pCMV-Myc真核表达载体构建成 pCMV-Myc／AP-2α，在细胞转染后表达Myc／AP-2α。进行双荧光素酶报告基因分析试验，以人血液基因组DNA为模板，通过PCR扩增得到人14-3-3σ基因启动子区域－1 050～＋299总长度为1 349bp的片断，将该片断经XhoⅠ／HindⅢ酶切位点插入pGL3-Basic质粒，获得pGL3／14-3-3σ质粒，PCR 引 物 为：5′-CCG CTC GAG TCT GTG AGC CCC GCT GGT AC-3′（sense）和5′-CCC AAG CTT GTA CTC ACG CAC CTC GGG CC-3′（antisense）。

1.4 荧光定量RT-PCR HeLa细胞接种在6孔板，转染细胞后48h收集细胞，用Trizol提取总RNA，按Promega的反转录试剂盒说明书进行反转录，用SYBR Green PCR Master Mix试剂盒进行荧光定量PCR。反应条件为95℃5min；95℃预变性15s，60℃退火15s，72℃延伸32s；40个循环（最后72℃延伸32s收集荧光信号）。PCR引物为如下：CAC TGT CCT CCC TTA AAA GCA（AP-2αsense），ATC TGG GCA ACA AAG GAC TA（AP-2αantisense）；GAA CTT TTC CGT CTT CCA CTA C（14-3-3σsense），TCC ACA GTG TCA GGT TGT CT（14-3-3σantisense）；CCT GGA TAC CGC AGC TAG GA（内参照18srRNA sense），GCGGCGCAATACGAATGCCCC（内参照18srRNA antisense）。

1.5 Western blot HeLa细胞接种在6孔板，转染细胞后48h收集细胞，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液（pH7.5的25mmol／L Tris-HCl，137mmol／L NaCl，2.7mmol／L KCl和1%Trixon X-100）充分裂解，离心收集上清液。聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳分离，转移蛋白质到聚偏氟乙烯（polyvinylidene flroride，PVDF）膜上，5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，用 AP-2α和14-3-3σ鼠单克隆抗体（Santa Cruz公司）室温孵育1h，膜洗3次，辣根过氧化物酶标记的二抗（武汉博士德）室温孵育1h，膜洗3次，增强化学发光法（普利莱基因技术有限公司）显影。

1.6 软件分析14-3-3σ的启动子 应用UCSC基因组浏览器查找人14-3-3σ基因的启动子序列并进行转录因子 AP-2α的结合位点分析。

1.7 双荧光素酶报告基因分析试验 用Promega公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System （E1910）进行样品荧光素酶活性检测，方法：转染前1d，细胞以1×104／cm2的密度接种于24孔板上，细胞转染48h后加入PBS清洗细胞，再加入100μL被动裂解缓冲液，室温轻微振摇15min，收集细胞裂解液。转染48h后加入PBS清洗细胞，再加入100μL PLB，室温轻微振摇15min，收集细胞裂解液。使用手动的双荧光检测仪（Promega，GloMax生物发光检测仪）读值。

1.8 统计学处理 采用SPSS12.0统计软件进行多组均数间比较，结果数据以±s表示，方差齐性检验后进行单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 AP-2α对14-3-3σmRNA 水平的影响 在 HeLa细胞内转染pCMV-Myc／AP-2α过表达质粒后，与转染空质粒pCMVMyc相比较，AP-2α的 mRNA 水平显着增高，同时14-3-3σ的mRNA水平也上升。当转染AP-2αsiRNA干扰AP-2α后，与转染对照siRNA相比，AP-2α的mRNA水平明显降低，同时14-3-3σ的mRNA水平也降低，1组和2组相比差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。同时转染pCMV-Myc／AP-2α过表达质粒和 AP-2αsiRNA，与单独转染pCMV-Myc／AP-2α过表达质粒相比，结果显示AP-2αsiRNA能明显干扰AP-2α的过表达，同时14-3-3σ的mRNA水平也降低，3组和6组相比差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05），见图1。

2.2 AP-2α对14-3-3σ蛋白水平的影响 在 HeLa细胞内转染pCMV-Myc／AP-2α过表达质粒后，与转染空质粒pCMVMyc相比较，AP-2α的蛋白水平显着增高，同时14-3-3σ的蛋白水平也上升。当转染AP-2αsiRNA干扰AP-2α后，与转染对照siRNA相比，AP-2α的蛋白水平明显降低，同时14-3-3σ的蛋白水平也降低。同时转染pCMV-Myc／AP-2α过表达质粒和 AP-2αsiRNA，与单独转染pCMV-Myc／AP-2α过表达质粒相比，结果显示AP-2αsiRNA能明显干扰AP-2α的过表达，同时14-3-3σ的蛋白水平也降低，见图2。

图1 荧光定量RT-PCR结果

图2 Western blot结果

2.3 人14-3-3σ基因启动子软件分析结果 应用UCSC基因组浏览器查找人14-3-3σ基因的启动子序列并进行转录因子AP-2α的结合位点分析，显示了人14-3-3σ基因启动子区域转录起始位点上游－1 050bp至转录起始位点下游299bp共1 349bp长度的基因序列。在这1 349bp的启动子区域预测到有10个AP-2α结合位点，见图3。

2.4 AP-2α对人14-3-3σ基因转录活性的影响 HeLa细胞被转染以pGL3-Basic质粒时，检测到的荧光素酶活性极低，pGL3-Basic质粒与pCMV-Myc／AP-2α质粒共转染时，荧光素酶活性仍然很低，说明AP-2α蛋白的过表达对pGL3-Basic质粒的转录活性没有明显影响。细胞被转染以pGL3／14-3-3σ质粒后，与对照组pGL3-Basic组相比较，荧光素酶活性显着增高（3组和1组），说明14-3-3σ启动子在HeLa细胞中有很强的转录活性。pGL3／14-3-3σ质粒和 pCMV-Myc／AP-2α质粒共转染时，与单独转染pGL3／14-3-3σ质粒相比较，荧光素酶活性显着增强，说明 AP-2α蛋白可以增强14-3-3σ启动子的转录活性，见图4。

图3 UCSC基因组浏览器在线分析人14-3-3σ基因启动子结果

图4 双荧光素酶报告基因分析试验结果

3 讨 论

哺乳动物的14-3-3蛋白家族至少有7种异构体，即β、γ、ε、ζ、η、σ和τ，它们能与磷酸化蛋白相结合，从而调节细胞活性，在应激反应后发生的细胞DNA损伤——有丝分裂前期的周期阻滞中发挥着重要作用［4］。14-3-3家族的成员σ在正常皮肤的基底细胞高表达，是上皮类细胞的标志分子［5］；并且已经证实14-3-3σ在多种上皮来源的肿瘤中发挥了作用，通过与CDC2、cyclinB结合形成复合物影响细胞周期与细胞凋亡［6－8］。

有文献报道14-3-3σ基因受到包括P53在内的多种转录因子的直接调控，14-3-3σ蛋白反过来又能与P53等转录因子相螯合，通过以下3种可能途径影响转录因子发挥作用：（1）14-3-3σ蛋白与转录因子相螯合影响了转录因子与下游基因的DNA结合；（2）14-3-3σ蛋白与转录因子相螯合影响了转录因子自身的蛋白水解；（3）14-3-3σ蛋白与转录因子相螯合影响了转录因子与其他蛋白的相互作用［7，9－10］。但直至目前，14-3-3σ是否与另一个转录因子AP-2发生相互作用尚未见报道。

AP-2是一个重要的转录因子家族，它参与脊椎动物生长发育、细胞周期与细胞凋亡调节，病理状态下参与肿瘤的发生、发展。哺乳动物 AP-2家族存在5个亚型：AP-2α、AP-2β、AP-2γ、AP-2δ和 AP-2ε，其中，AP-2α与上皮组织关系密切，在成年小鼠中，AP-2α的表达主要集中在皮肤、前列腺、胸腺、眼睛和骨骼肌，AP-2β的表达主要集中在肾脏，AP-2γ主要在胎盘表达。在正常人上皮组织中，AP-2α在基底细胞层表达，AP-2γ在基底细胞、棘细胞和颗粒细胞层表达，而在上皮内未检测到 AP-2β的表达［11］。最近 研究 发 现 AP-2与乳腺癌［12，13］、卵巢癌［14］、肺癌［15］、睾丸癌［16］、黑色素瘤［17］等上皮来源的肿瘤相关，并通过调控细胞周期与凋亡途径参与肿瘤发生、发展。以前的研究也证实，AP-2α能促使宫颈鳞状上皮癌细胞系He-La细胞凋亡［18］。

由于AP-2α与14-3-3σ均在正常上皮组织高表达，它们在上皮来源的肿瘤中发挥了重要作用，因此，AP-2α与14-3-3σ可能在肿瘤发生、发展中存在密切联系。本研究对AP-2α在宫颈癌细胞系 HeLa细胞中调控14-3-3σ的作用进行了初步探讨，发现 AP-2α在 HeLa细胞内正调控14-3-3σ的 mRNA水平和蛋白水平。由于AP-2α是转录因子，通常是通过其蛋白的DNA结合域与下游基因启动子区域的AP-2结合位点相结合来直接调控下游基因的转录，因此，用软件分析了人14-3-3σ基因的启动子，结果发现在人14-3-3σ基因启动子区域转录起始位点上游－1 050bp至转录起始位点下游299bp之间，存在10个潜在的AP-2结合位点，双荧光素酶报告基因分析试验结果证实了AP-2α可以增强14-3-3σ启动子的转录活性。

本研究结果首次证实了AP-2α正调控HeLa细胞内14-3-3σ的表达，并揭示了这种调控作用可能是通过AP-2α增强14-3-3σ启动子的转录活性来完成的。为深入探讨AP-2α调控14-3-3σ的作用奠定了基础，为阐明 AP-2α和14-3-3σ在上皮肿瘤中的作用提供了新思路。

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