娄伦美，董 志△，傅洁民，曾凡新，姜立花
（1.重庆医科大学药学院 400016；2.重庆复创医药研究有限公司 400061）
YN33系列化合物抗肿瘤作用的初步研究＊
娄伦美1，董 志1△，傅洁民2，曾凡新2，姜立花2
（1.重庆医科大学药学院 400016；2.重庆复创医药研究有限公司 400061）
目的从8个YN33系列表皮生长因子受体（EGFR）蛋白酪氨酸酶抑制剂中筛选具有抗肿瘤活性的化合物，并进一步评价其在体外的抗肿瘤效果。方法首先采用体外激酶实验对YN33系列化合物进行初步筛选，观察它们对EGFR蛋白酪氨酸酶的抑制作用；采用MTS法观察筛选出的活性化合物在体外对人表皮癌A431细胞株、人胃癌N87细胞株和人乳腺癌BT474细胞株的增殖抑制作用，以及体外筛选出的YN33－5化合物对人正常胚肺成纤维MRC－5细胞增殖的抑制作用。结果激酶实验结果，发现4个具有抑制EGFR活性的化合物：YN33－3，YN33－5，YN33－6，YN33－8。YN33－5对 A431、BT474、N87细胞株的半数抑瘤浓度（IC50）分别为：（9.743 3±2.795 9）μmol/L，（4.611 7±2.222 5）nmol/L和（44.048 3±21.793 1）nmol/L，抑制效应呈剂量依赖性。结论YN33－5具有较好抗肿瘤活性，可抑制多种肿瘤细胞的增殖。
受体，表皮生长因子；抗肿瘤活性；MTS法
表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）属于erbB家族成员之一，是由胞外配体结合区，跨膜区具有酪氨酸激酶活性的胞内区3个部分组成的跨膜糖蛋白。EGFR在多种恶性肿瘤存在表达，如神经胶质细胞瘤、乳腺癌等恶性肿瘤细胞中都有过度表达，激活EGFR会促进肿瘤细胞增殖，肿瘤血管生成及肿瘤转移，阻碍肿瘤凋亡［1］。国外已开发了多种临床疗效较好的酪氨酸激酶靶向药物，但目前这些药物有诸多缺点，如抗瘤谱窄、仅对部分肿瘤有效、远期疗效和安全性尚不明确，而且价格昂贵导致这些药物的临床应用受到很大限制。为研发更有效的EGFR酪氨酸激酶抑制剂，以Lapatinib为母核进行结构改造，合成了YN33系列化合物。本研究通过对该系列化合物进行体外筛选，期望发现具有较强抗肿瘤活性的化合物。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验细胞株 人表皮癌A431细胞株、人乳腺导管癌BT474及人胃癌N87细胞株和人正常胚肺成纤维MRC－5细胞株，均购自上海中科院细胞库。A431、BT474和 MRC－5细胞株用DMEM培养液培养，在BT474和MRC－5细胞株的培养液需加入1.0mmol/L的丙酮酸钠；N87细胞株用RPMI1640培养液培养，需加入110mg/L的丙酮酸钠及10 mmol/L的羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）。均置于5%CO2、37℃培养箱中培养，每隔3～4d传代1次，取对数生长期细胞用于实验研究。
1.1.2 试药与试剂 YN33系列化合物共8个样品和阳性对照药Lapatinib，均由重庆复创医药有限公司提供，纯度为95%，呈黄色粉末状，用二甲基亚砜（DMSO）溶解，配制成20 mmol/L溶液，－80℃保存备用使用前用超纯水或培养液配制成所需浓度。ADP－GloTM激酶检测试剂盒及MTS为Promega公司产品；DMEM培养基、RPMI1640培养基及胎牛血清（FBS）为Gibco公司产品；胰蛋白酶和台盼蓝为Sigma公司产品；DMSO为国药公司产品。
1.2 方法
1.2.1 ADP－GloTM激酶检测YN33系列化合物对EGFR激酶活性的影响 运用ADP－GloTM激酶检测试剂盒检测YN33系列化合物对EGFR激酶的抑制活性测定，以Lapatinib作为阳性对照药物验证筛选模型的灵敏度和稳定性。所有反应均在96孔酶标板中完成，经过酶浓度筛选每孔分别加入0.5U/mL的酶液10μL。为减少加样时的误差，将酶以外的其余试剂混合，分别加入超纯水2.5μL、反应缓冲液（5倍）5μL、ATP（1 μmol/L）2.5μL及底物（500μmol/L）2.5μL，混匀后，取12μL混合物后，加入待测化合物（100nmol/L）2.5μL，最后加入酶液，反应总体积为25μL。实验分组为：实验组、化合物组、无酶对照组及阴性对照组。将化合物组，无酶对照组及阴性对照组在30℃保温反应60min后，避光加入荧光素酶/荧光素反应检测试剂25μL。在450nm吸光处测定吸光值（OD值），计算抑制率（CI），公式如下：CI（%）＝（化合物OD值－阴性对照孔OD值）/（无酶对照孔OD值－阴性对照孔OD值）×100%。
表1 培养时间和给药浓度对照表
1.2.2 YN33系列化合物对肿瘤细胞及 MRC－5细胞的增殖抑制实验 将A431，BT474和N87肿瘤细胞株及 MRC－5正常细胞株按照常规方法传代，取对数生长期的细胞，用0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）消化后配成单细胞悬液（细胞悬液浓度表1），接种于96孔板，每孔100μL，置37℃和5%CO2的培养箱中培养各自对应的时间（培养时间表1）后，A431和N87细胞株需要将培养液吸出，再加入100μL含不同浓度待测化合物和对照药的培养液（给药浓度见表1），BT474和MRC－5细胞株是直接加入，3种细胞均为9个浓度梯度。实验设药物处理组、实验对照组和空白对照组，每组均设3个复孔。置37℃和5%CO2的培养箱中培养各自对应的时间后（表1），吸出培养液，用PBS轻轻冲洗几次后，加入100μL的无血清培养基，再加入10μL的MTS，继续培养2h，于多功能酶标仪490nm波长处测吸收度值（A490nm），按下式计算CI，并采用GraphPad Prism5软件计算半数抑瘤浓度（IC50）值。肿瘤细胞生长CI（%）＝［1－（药物处理组OD值－空白对照组OD值）/（实验对照组OD值－空白对照组OD值）］×100。
1.3 统计学处理 应用SPSS13.0统计件进行统计学分析。数据±s表示，多样本均数比较用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 YN33系列化合物对EGFR激酶活性的影响 在筛选中发现，YN33系列化合物对EGFR激酶均表现出不同的抑制作用，以Lapatinib为对照，从实验结果显示，YN33－5化合物能明显抑制EGFR激酶的活性，而YN33－4抑制EGFR激酶活性很弱，与Lapatinib比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。
2.2 对肿瘤细胞生长的影响 经过数据分析，选定YN33－3，YN33－5，YN33－6，YN33－8化合物进行肿瘤细胞增殖抑制实验。从筛选中发现，YN33系列化合物对A431、BT474及N87细胞株均表现出了不同程度的抑制作用，表现为浓度依赖性（表3）。以Lapatinib为对照，其中YN33－5化合物对3种细胞具有较强的增殖抑制作用，同时表现了良好的量效关系。
2.3 对正常细胞生长的影响 通过肿瘤细胞增殖抑制实验，发现YN33－5化合物具有较强的抗肿瘤活性，故选定YN33－5化合物检测其对人正常胚肺成纤维 MRC－5细胞的影响，以Lapatinib为对照，实验结果显示，Lapatinib和 YN33－5对MRC－5 细 胞 IC50为 （40.541 7±8.061 6）μmol/L 和（28.345 0±3.651 4）μmol/L。YN33－5化合物对 MRC－5细胞的杀伤作用相对Lapatinib较强，差异有统计学意义（P＜0.05）。
表2 对EGFR激酶活性的影响（±s，n＝6）
表2 对EGFR激酶活性的影响（±s，n＝6）
－：表示无数据。
待测物 CI（%）PLapatinib 38.738 9±3.368 3 －YN33－2 30.500 0±9.502 6 ＜0.05 YN33－3 32.166 7±8.727 4 －YN33－4 0.233 3±0.135 5 ＜0.05 YN33－5 42.000 0±11.781 3 ＜0.01 YN33－6 19.729 7±3.668 4 －YN33－7 18.833 3±7.884 6 ＜0.05 YN33－8 31.212 0±3.593 4 －YN33－9 0.351 0±0.234 8 ＜0.05
表3 对肿瘤细胞的生长抑制作用（±s，n＝6）
表3 对肿瘤细胞的生长抑制作用（±s，n＝6）
a：P＜0.05；b：P＜0.01，与Lapatinib比较。
待a
3 讨 论
抗肿瘤药物抑制作用的体外实验是整个抗肿瘤药物药理研究过程中的重要环节，在筛选有效的抗癌药物，辅助判断抗癌药物的抗癌谱等方面均有重要价值。乳腺癌细胞中存在EGFR的高表达可用于预测其病情的发展与疗效及预后的判定［1］。EGFR胞内结构的酪氨酸激酶活性是EGFR发挥生物学作用的主要途径，抑制该酶活性可获得相似的抗肿瘤作用。Lapatinib（GW572016）为6－噻唑基喹唑啉，是一个可逆性的酪氨酸激酶抑制剂，生化试验中表现出选择性抑制EGFR家族激酶EGFR和 HER－2，是由Glaxo Wellcome公司研发针对EGFR/HER－2的双重抑制剂［2］。
Lapatinib可抑制EGFR和HER－2磷酸化激活及细胞增殖。有文献报道，Lapatinib的抗增殖作用在高表达HER－2的细胞中较强，而在低表达 HER－2或表达EGFR的细胞中较弱［3］。Lapatinib对乳腺癌细胞增生的抑制呈浓度依赖性，不同细胞株的IC50不同，在某些乳腺癌细胞株中，IC50＜0.2μmol/L时，Lapatinib即可发挥作用，显示出强大的抗增殖作用［4］。有研究显示，Lapatinib可明显抑制BT474（HER2过表达的乳腺癌细胞株［5］）细胞中p95的磷酸化及移植瘤的生长［6］，A431细胞为 EGFR过表达细胞株［7］。
在抗肿瘤增殖抑制实验中，设定了相应DMSO浓度的阴性对照，以消除DMSO对细胞活性的影响，同时将各实验组的DMSO浓度控制在0.1%以内，以尽量减少对实验的影响。从实验结果中发现，虽然A431细胞株的EGFR水平都比较高，但Lapatinib对 A431细胞的IC50在（22.540 0±7.436 8）μmol/L。在文献中报道，Lapatinib对EGFR/HER－2的IC50分别为10.2nmol/L和9.8nmol/L［8］，对 A431、BT474、N87细胞株的IC50小于1.6×102nmol/L［2］。Lapatinib在BT474、N87细胞株中的IC50分别为 （5.713 3±4.027 8）nmol/L 和（45.750 0±8.539 8）nmol/L，均小于1.6×102nmol/L。提示肿瘤细胞对活性化合物的敏感性可能与EGFR表达水平无明显相关性，或者并不仅仅与之相关。经过对YN33系列化合物的体外筛选，本研究发现YN33系列化合物对A431、BT474、N87 3个肿瘤细胞株均表现出不同程度的抑制作用，而且呈明显的量效关系，在所设浓度范围内，其抑制作用随浓度的增加而增强，并从中发现YN33－5化合物具有显着的抗肿瘤活性，与初步筛选实验结果相符。
在实验筛选中，发现YN33－5化合物的作用与Lapatinib相当，但在正常细胞生长抑制实验中发现，YN33－5化合物对MRC－5细胞株的杀伤作用略高于Lapatinib，差异有统计学意义。由于只选用了一种正常细胞株来检测YN33－5化合物对正常细胞的细胞毒作用，还不足以说明YN33－5化合物的毒副作用。
综上所述，在本研究中，进行体外初步筛选，发现了YN33－5化合物是具有显着抗肿瘤活性的化合物。但对于化合物对肿瘤的治疗效果不能仅仅依靠对肿瘤细胞的抑制作用，还必须确认其能够在复杂的体内环境中抑制肿瘤的生长。本研究只表明了YN33－5化合物在体外有显着的抗肿瘤活性，其通过抑制EGFR激酶而抑制肿瘤细胞生长的确切机制，需要对其在体内的抗肿瘤活性作进一步的研究。
［1］谢富华，王润秀，梁念慈.表皮生长因子受体家族信号转导途径与乳腺癌关系的研究进展［J］.国际检验医学杂志，2006，27（11）：1004－1005.
［2］陶黎阳，符立梧.EGFR/HER－2双受体酪氨酸激酶抑制剂拉帕替尼的研究进展［J］.中国药理学通报，2008，24（12）：1541－1544.
［3］Konecny GE，Pegram MD，Venkatesan N，et al.Activity of the dual kinase inhibitor lapatinib（GW572016）against HER－2－overexpressing and trastuzumab－treated breast cancer cells［J］.Cancer Res，2006，66（3）：1630－1639.
［4］Xia W，Mullin RJ，Keith BR，et al.Anti－tumor activity of GW572016：a dual tyrosine kinase inhibitor blocks EGF activation of E8GFR/erbB2and downstream Erk1/2and AKT pathways［J］.Oncogene，2002，21（41）：6225－6263.
［5］Evans AH，Pancholi S，Farmer I，et al.EGFR/HER2inhibitor AEE788increases ER－mediated transcription in HER2/ER－positive breast cancer cells but functions synergistically with endocrine therapy［J］.Br J Cancer，2010，102（8）：1235－1243.
［6］Xia W，Liu LH，Ho P，et al.Truncated ErbB2receptor（p95ErbB2）is regulated by heregulin through heterodimer formation with ErbB3yet remains sensitive to the dual EGFR/ErbB2kinase inhibitor GW572016［J］.Oncogene，2004，23（3）：646－653.
［7］Ciardiello F，Caputo R，Bianco R，et al.Antitumor effect and potentiation of cytotoxic drugs activity in human cancer cells by ZD1839（Iressa），an epidermal growth factor receptor－selective tyrosine kinase inhibitor［J］.Clin Cancer Res，2000，6：2053－2063.
［8］Rusnak DW，Lackey K，Affleck K，et al.The effects of the novel，reversible epidermal growth factor receptor/ErbB－2 tyrosine kinase inhibitor，GW572016，on the growth of human normal and tumor－derived cell lines in vitro and in vivo［J］.Mol Cancer Ther，2001，1（2）：85－94.
Preliminary study on the anti－tumor role of YN33 series compounds＊
LouLunmei1，DongZhi1△，FuJiemin2，ZengFanxin2，JiangLihua2
（1.SchoolofPharmacy，ChongqingMedicalUniversity，Chongqing400016，China；2.ChongqingFuchuang PharmaceuticalResearchInstitute，Chongqing400061，China）
ObjectiveTo screen 8series of YN33compounds，which are EGFR tyrosine kinase inhibitors，and evaluate their anti－tumor effectinvitro.MethodsPreliminary screening was carried out by detecting the EGFR kinase phosphorylation inhibition activity of the compounds.MTS assay was adopted for secondary anti－tumor screen of the selected compounds using A431，N87and BT474cell linesinvitro.And we investigated the influence caused by the screened compound YN33－5in normal cells，MTS assay was carried out in MRC－5cell line as well.ResultsAccording to the kinase assay，4compounds were selected，which were YN33－3，YN33－5，YN33－6，and YN33－8.The IC50of YN33－5in inhibition of A431，BT474and N87cell lines proliferationinvitrowas（9.743 3±2.795 9）μmol/L，（4.6117±2.222 5）nmol/L and（44.048 3±21.793 1）nmol/L，and the inhibition effect were dose－dependent.ConclusionYN33－5is probably an effective EGFR tyrosine kinase inhibitor with significant anti－tumor activity.
recetptor，epidermal growth factor；anti－tumor activity；MTS assay
10.3969/j.issn.1671－8348.2012.33.015
A
1671－8348（2012）33－3498－03
国家科技部重大专项（010ZX09401－306－1－1）。△ 通讯作者，Tel：13508393231；E－mail：zhidong073＠hotmail.com。
2012－04－04
2012－06－18）
