张战民，张晓华

(南昌大学第一附属医院肿瘤科，南昌 330006)

Wnt信号通路是一个复杂的蛋白质作用通路，其参与细胞的增殖、分化、代谢及凋亡，是细胞发育所必需的[1]，调节着细胞行为及细胞的相互作用，因此，此通路不仅在胚胎发育调控中起至关重要的作用，而且与肿瘤的发生和发展密切相关[2]。研究表明，Wnt信号通路与多种肿瘤的的生长、复发和耐药有着密切的关系[3-4]。本研究通过沉默Wnt1基因的表达，观察乳腺癌细胞对多柔比星敏感性的变化，为寻找克服乳腺癌耐药性的新靶点提供依据,现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1材料 人乳腺癌MCF-7/ADR细胞株由中国医学科学院血液学研究所提供，此细胞株的原代培养细胞供体均一，取材部位及组织类型稳定，为已鉴定细胞；PRMI 1640培养基和胎牛血清购于美国Gibco公司，四甲基偶氮唑盐(MTT)、青霉素、链霉素、多柔比星为美国Sigma公司产品，总RNA提取试剂盒采用美国Promega公司产品，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒为日本Takara公司生产，Lipofectamine 2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司，Wnt1 siRNA双链干扰序列由上海吉玛制药技术有限公司合成。

1.2方法

1.2.1MCF-7/ADR细胞在Wnt1基因沉默前后对多柔比星耐药性的比较

1.2.1.1MCF-7/ADR细胞的培养 采用含10％胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素、RPMI 1640的完全培养基，在37 ℃、5％CO2的饱和湿度条件下培养，每2～3 d换液并传代1次，采用0.02％乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2和0.25％胰蛋白酶的1∶1混合液进行消化，且使多柔比星梯度诱导浓度最终维持在1 μg/mL。

1.2.1.2细胞总RNA的提取及光密度值的测定 培养出的MCF-7/ADR细胞每(1～5)×106个细胞加1 mL TRIzol试剂，吸管吹吸数次，15～30 ℃孵育5 min后，加0.2 mL氯仿，摇匀15 s，15～30 ℃孵育2～3 min，4 ℃离心15 min(离心半径8 cm，12 000 r/min)。上清液移入另一EP管内，加入0.5 mL异丙醇，4 ℃离心10 min(离心半径8 cm，12 000 r/min)，加75％乙醇1 mL，震荡混匀，4 ℃离心5 min(离心半径8 cm，7 500 r/min)，吸去上清液，晾干5～10 min，加入焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解，55～60 ℃促溶10 min。采用紫外分光光度计测定细胞总RNA在260 nm和280 nm处的吸光度(A)值，计算RNA的含量和纯度。所有样品的A260/A280均介于1.9～2.1之间，并根据260 nm吸光度定量。

1.2.1.3RT-PCR的检测 取DEPC处理过的细胞溶液0.2 mL，加入下列反应组分：2.6 μg RNA、1 μL随机引物(50 ng/μL)，1 μL三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)10 mmol，4 μL 5×RT缓冲液，1 μL高效率逆转录酶(日本ReverTra Ace公司)，DEPC溶液补足至20 μL，室温放置10 min，37 ℃保温30 min，95 ℃ 5 min使酶失活，置于4 ℃ 1～5 min，完成cDNA的合成，所得cDNA产物于-20 ℃保存。于0.2 mL PCR反应管中加入下列反应组分：2 μL cDNA、2.25 μL 10×PCR缓冲液、0.5 μL dNTP(10 mmol)、25 pmol上游Wnt1引物、25 pmol下游Wnt1引物或0.5 μL甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)引物，0.5 μL TaqDNA聚合酶，灭菌水补足至25 μL。Wnt1及β-actin的引物序列(表1)，扩增反应条件：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，扩增30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃终止反应，1.5％琼脂糖凝胶电泳45 min。

表1 引物序列

1.2.1.4RNA干扰实验 MCF-7/ADR细胞接种于6孔板，当细胞达到50％融合时，按照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书进行基因转染实验。化学合成的靶向Wnt1亚基的siRNA 双链干扰序列为：5′-CCU CGU CUA CUU CGA GAA ATT-3′(正义链)，5′-UUU CUC GAA GUA GAC GAG GT-3′(反义链) 。

1.2.1.5MCF-7/ADR细胞的生长抑制实验 将MCF-7/ADR细胞分为4组，(1)对照组：细胞中只采用培养基进行培养；(2)Wnt1沉默组：MCF-7/ADR细胞加siRNA干扰处理；(3)多柔比星组：用多柔比星处理MCF-7/ADR细胞；(4)Wnt1沉默联合多柔比星组：Wnt1沉默MCF-7/ADR后用多柔比星处理 。将细胞制成单细胞悬液，以每孔2×105个细胞接种于96孔培养板中，各组分设3个复孔，在37 ℃、5％ CO2的饱和湿度下培养24 h，细胞贴壁后加入终浓度为20 μg/mL的多柔比星，继续培养24 h，每孔加入0.5 mg/mL MTT反应4 h，弃去培养基，加入二甲基亚砜(DMSO)100 μL，震荡10 min，使结晶物充分溶解，实验重复3次。选择570 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔A值，计算细胞生长抑制率，比较Wnt1基因沉默前、后MCF-7/ADR细胞对多柔比星耐药性的变化。细胞抑制率=[1-实验组A值/对照组A值]×100％。

1.2.2免疫印迹法(Western blotting)检测蛋白的表达 将各组细胞重悬，分别收集1×106个细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤1次，离心去除上清液，加入细胞裂解液，室温匀浆1 min，然后4 ℃离心15 min。取上清液作为样品。5％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，离心10 min(离心半径8 cm，12 000 r/min)，上清液即为细胞总蛋白。50 μg细胞总蛋白行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，80～120 V电泳2 h，80 V转印2 h；PBS洗膜10 min，加入包被液封闭过夜；再用PBS洗膜3次，加入 第一抗体(1∶400)和β-actin鼠抗人单克隆抗体(1∶400)，室温孵育2 h；PBS洗膜2次，与第二抗体室温孵育2 h；PBS洗膜2次，加入显色液显色15 min，显色的硝酸纤维素膜经UPV扫描仪扫描成像。

2 结 果

2.1Wnt1基因沉默前后MCF-7/ADR细胞对多柔比星敏感性的变化 对照组、Wnt1沉默组、多柔比星组及Wnt1沉默联合多柔比星组的细胞存活率分别为(100.0±5.2)％、(84.3±4.1)％、(68.7±4.7)％和(42.3±3.5)％，其中，Wnt1沉默组、多柔比星组及Wnt1沉默联合多柔比星组细胞的存活率与对照组比较，差异有统计学意义(F=5.381，P<0.05)，Wnt1沉默联合多柔比星组细胞的存活率最低。

2.2Wnt1基因沉默前后MCF-7/ADR细胞中Wnt1基因及蛋白质的表达 RT-PCR检测结果显示，空白对照组、脂质体对照组及阴性对照组MCF-7/ADR细胞中Wnt1 mRNA的扩增产物呈清晰条带；用化学合成的双链siRNA沉默Wnt1基因，转染48 h后收集细胞，MCF-7/ADR细胞中Wnt1 mRNA的表达明显下调(图1)。Western blotting检测上述4组Wnt1蛋白的表达情况，发现其与Wnt1基因mRNA表达的变化一致，说明siRNA转然后抑制了Wnt1基因的转录过程，同时也抑制了相应蛋白的翻译和表达，见图1。

1：空白对照组；2：脂质体对照组；3：阴性对照组；4：Wnt1 siRNA转染组。

3 讨 论

肿瘤多药耐药(MDR)是临床恶性肿瘤化疗的主要障碍，也是乳腺癌患者化疗失败、复发转移的主要原因[5]。MDR发生机制复杂，已有许多研究阐述了乳腺癌化疗耐药的机制，如P-糖蛋白(P-gp)[6]、多药耐药相关蛋白(MRP)[7]和乳腺癌耐药蛋白的过表达[8]，导致肿瘤细胞内化疗药物的浓度降低以及谷肤甘肤S转移酶(GSTS)酶性解毒作用的增强等[9]。随着细胞技术的成熟，细胞信号通路与肿瘤多药耐药的关系已成为MDR机制和逆转治疗研究的新亮点。

近年来的研究表明，Wnt/β-catenin信号通路的激活，参与了肿瘤的发生及其侵袭转移的过程，而且还与肿瘤干细胞的关系密切，是调控肿瘤干细胞增殖与分化的一个重要信号通路[10-11]。Milovanovic等[12]在研究中用原位RNA杂交法检测了正常乳腺组织和恶性乳腺癌组织的Wnt配体Wnt1、Wnt2、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7和Wnt10b的表达情况，发现Wnt1和Wnt6在正常和恶性组织中均强烈表达，Wnt7b在乳腺癌组织中下调。目前，认为，Wnt通路致癌的关键是β-catenin降解障碍致使胞浆内游离的β-catenin聚集并与Tcf/Lef结合进入细胞核，激活下游靶基因Cyclin D1、C-myc的转录，导致肿瘤的发生。Cyclin D1是调节细胞进入细胞周期中增生期的主要因子，已被证实为原癌基因，其过度表达和失调控均可导致细胞周期调控异常从而发生肿瘤[13-15]。鉴于Wnt1在小鼠乳腺癌中的作用和人类乳腺癌中的表达，本文检测了Wnt1基因的mRNA在乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7细胞中的表达，经RT-PCR检测结果发现Wnt1在乳腺癌细胞呈高表达，使用化学合成的双链siRNA沉默Wnt1基因，可显着下调Wnt1 mRNA的表达，Wnt1蛋白的表达也明显减弱，说明siRNA转染后抑制了Wnt1基因的转录过程，同时也抑制了相应蛋白的翻译和表达。本研究通过MTT试验发现，沉默后的MCF-7/ADR细胞对多柔比星的敏感性明显增强，表明沉默Wnt1基因可以部分逆转MCF-7/ADR细胞对多柔比星的耐药性。

综上所述，Wnt1基因在乳腺癌细胞呈高表达，沉默Wnt1基因下调Wnt1基因的转录和翻译，能显着增强乳腺癌细胞对多柔比星的敏感性，部分逆转其对多柔比星的耐药性，说明Wnt/β-catenin信号通路可能在乳腺癌多药耐药中具有重要作用，为寻求克服MDR开辟了新的方向。

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