王洪波，张梦亮，张芸辉，杨 艳，张宝昌△
（1.长春工业大学化学与生命科学学院，长春130012；2.吉林大学生命科学学院，长春130012）
异丙肌苷原为一抗病毒药，对人体疱疹、流感及鼻病毒感染均有疗效，用于单纯疱疹病毒感染的患者疗效显着。现发现异丙肌苷具有增强机体免疫功能的作用，主要是增强细胞免疫功能，作为一新的免疫调节剂，在国外临床上广泛应用［1-9］。异丙肌苷由肌苷与二甲胺基异丙醇-对乙酰胺基苯甲酸盐（1∶3）3部分组成，易水解成为肌苷、二甲胺基异丙醇、对乙酰胺基苯甲酸，以往有关异丙肌苷的体内药代动力学报道甚少。本试验建立了快速、灵敏的测定血浆中肌苷浓度的液相色谱-串联质谱（LC-MS／MS）分析方法，并对4名健康受试者口服1g异丙肌苷后肌苷的体内药代动力学过程进行了初步的研究。
1 材料与方法
1.1 仪器和药品 三重四极杆串联质谱仪，型号 API 4000，配有电喷雾离子源（加拿大Applied Biosystem公司）；Agilent 1100高效液相色谱系统（美国Agilent公司）；TGL-16G-A高速台式冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）。
肌苷对照品（浓度为99.8%，上海微蒙生物科技有限公司提供，批号：140669-200702）；内标阿德福韦对照品（浓度99.0%，葛兰素史克苏州制药公司提供，批号：9002）；色谱纯级别甲醇由Sigma-Aldrich有限公司提供，其他试剂为分析纯级别；人血浆由吉林大学附属第一医院提供。
1.2 实验方法
1.2.1 色谱／质谱条件 色谱条件 Agilent SB-C18色谱柱，5 μm粒径，150.0mm×4.6mm I.D.，美国 Agilent公司；流动相：甲醇∶10mmol／L 乙酸铵-水溶液（15∶85，v／v）；流速：1mL／min；柱温：40℃；进样量：5μL。质谱条件 离子源：ESI离子源；喷射电压：-4 000V；温度：500℃；源内气体（N2）GS1、GS2和气帘气体压力分别为：40psi、40psi和15psi；正离子方式检测；扫描方式为多重反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）；肌苷的解簇电压（DP）、碰撞能量（CE）分别为-78V和-30eV；内标阿德福韦的DP和CE分别为-75 V和-50eV；用于定量分析的离子对分别为m／z母离子为267.3，子离子为135.0（肌苷）和 m／z母离子为272.0，子离子为134.1（内标阿德福韦）。
1.2.2 样品采集和处理 全血取出后置肝素化试管中，立即4℃离心（15 000r／min×5min），取出血浆置另一试管（每毫升血浆加100μL 30%高氯酸溶液），充分振荡混匀，低温离心（15 000r／min×5min），取上清液，于80℃冷冻待测。室温溶解，取100μL上清液，立即加入内标溶液100μL，充分振摇混匀后，取上清液5μL进行LC-MS／MS分析。
1.2.3 溶液的配制 称取25.0mg肌苷（分子式：C10H12N4O5）对照品，置于25mL容量瓶中，加甲醇-水定容至刻度，配制成1mg／mL的肌苷母液。
标准系列溶液的配制：取肌苷储备液适量，分别用室温放置超过3d后的空白血浆稀释至10、30、100、300、1 000、3 000 ng／mL。内标的配制：称取25.0mg阿德福韦，置于25mL容量瓶中，加甲醇-水定容至刻度，配制成1mg／mL的母液，取适量用甲醇水（1∶1，v／v）稀释至浓度为1μg／mL，即为内标溶液。
2 结 果
本试验参照相关指导原则进行了方法学确证［10］。
2.1 方法的专属性 分别取6名健康受试者的空白血浆（室温放置超过3d后的空白血浆）1 000μL，按血浆样品处理方法操作，得到空白样品色谱图（图1A）；将含有10ng／mL肌苷的血浆样品加入内标阿德福韦后，依同法操作，得到定量下限样品的色谱图（图1B）；取受试者给药后收集的血浆样品，依同法操作，得色谱图1C。结果表明：室温放置超过3d后的空白血浆内源性物质不干扰肌苷和阿德福韦的测定。
图1 测定人血浆中肌苷和内标阿德福韦的典型MRM色谱图
表1 血浆中肌苷LC-MS／MS测定方法的准确度与精密度（3个分析批，每分析批n＝6）
表2 血浆中肌苷的稳定性（n＝3）
2.2 标准曲线制备和定量下限 取用空白血浆（室温放置超过3d后的空白血浆）配制的标准系列溶液（10、30、100、300、1 000、3 000ng／mL）1000μL，按血浆样品处理方法操作，取5 μL进行LC-MS／MS分析；以肌苷标示浓度为横坐标，肌苷与内标物阿德福韦的色谱峰面积比值为纵坐标，以加权系数W＝1／χ2进行线性回归［11］，得到标准曲线的回归方程。典型的回归方程曲线为Y＝0.001 9 X-0.006 89（r＝0.995 4），其中Y为待测物与内标的峰面积比，X为标准系列溶液浓度。根据标准曲线，血浆中肌苷的线性范围为10～3 000ng／mL，定量下限（9.8±0.4）ng／mL（n＝6）。
2.3 精密度、准确度 取空白血浆（室温放置超过3d的空白血浆）配制的低、中、高3个浓度（30、300、2 400ng／mL）的质量控制（QC）样品，按血浆样品处理方法操作，每浓度6样本，连续测定3d。根据当日的工作曲线，计算QC样品测得浓度，根据QC样品结果计算本法的准确度与精密度，测定血浆中肌苷的准确度与精密度。见表1。
2.4 提取回收率和基质效应 取一定量空白血浆（室温放置超过3d的空白血浆），按血浆样品处理方法（不加入内标）操作，获得的空白血浆上清液，用此上清液配制低、中、高3个浓度的QC样品和内标，每浓度4个样本。将该样本进行LCMS／MS分析，获得相应峰面积，两种处理方法得到的峰面积比值（百分比）即为提取回收率。血浆样品中肌苷低、中、高3个浓度回收率分别为（96.7±3.45）%、（93.7±2.60）%、（93.2±2.58）%。用水配制的低、中、高3个浓度（30、300、2 400ng／mL）的质量控制（QC）样品，按照标准曲线制备方法操作，每浓度4个样本；同时取一定量空白血浆（室温放置超过3 d的空白血浆），按血浆样品处理方法（不加入内标）操作，获得的空白血浆上清液，用此上清液配制低、中、高3个浓度的QC样品和内标，每浓度四样本，进样分析，获得相应峰面积，以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算提取基质效应，分别为（98.9±9.09）%、（104.8±3.87）%、（102.5±6.20）%。
2.5 稳定性考察 依据“2.3”项下方法制备稳定性QC样品，每浓度3个样本，不经提取，经-80℃放置30d后，测定样品浓度；或经反复3次-20℃冰冻-溶解循环，测定样品浓度。结果（表2）表明：所有冻融试验测定值与添加值的相对偏差（R.E.%）均小于15%。即血浆样品可以进行反复冻融或在-80℃放置30d，不会影响测试结果的准确度。
试验中对处理后的QC样品（每浓度3个样本）进行了2.5 h室温放置稳定性考察，结果显示所有样品的试验测定值与添加值R.E.%均小于15%，说明分析测试过程中的样品较为稳定。
2.6 分析方法在药动学研究中的应用 4例健康受试者，男女各半。试验方案经吉林大学第一医院医学伦理委员会审核批准。向受试者解释知情同意，并签署受试者知情同意书进入该试验。受试者于服药前1d入住I期病房，并于第2天8：00口服1g异丙肌苷片（北京赛而生物药业有限公司生产，批号：20081215），温开水200mL送服。临床医生及研究者随时观察不良事件并对受试者进行监护。给药前、给肌苷药后10、20、30、45min，1.00、1.25、1.50、2.00、2.50、3.00、4.00、6.00h于上肢肘窝静脉取血5mL，按“1.2.2”操作，以当日标准曲线计算各时间点的血药浓度，测得的药时曲线见图2。由图2可见，给药前，健康受试者血浆基础肌苷在20～60ng／mL。
图2 4名健康受试者口服1g异丙肌苷后肌苷血药浓度-时间曲线
3 讨 论
3.1 肌苷作为一种内源性核苷类物质，对其定量分析报道不多。Jeng等［12］用LC-MS／MS同时定量分析了肝癌患者和健康人尿中7种核苷；David等［13］利用微渗析技术用 HPLCDAD检测了犬心肌缺血模型细胞间隙中5种核苷浓度；文献［14-15］报道用HPLC-DAD或HPLC-UV测定人血浆中内源性肌苷浓度。本实验建立了人血浆肌苷LC-MS／MS分析方法，该方法灵敏度高（定量下限10ng／mL），分析时间短，处理方法简单（一步沉淀蛋白），试用于高通量的药代动力学研究或临床样本检测。该方法已应用于健康受试者口服异丙肌苷后的体内药代动力学研究。
3.2 肌苷在全血和血浆中均不稳定。在全血中，嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）快速代谢肌苷成为次黄嘌呤（t1／2＜5min）；在血浆中，PNP的活力相对较低［14］。因此，为保证样品在处理过程中的稳定性，尽快按照“1.2.2”处理，置-80℃冰箱保存。高氯酸可以破坏酶的活性，所以高氯酸处理过的样品相对稳定。实验证明含肌苷的新鲜大鼠血浆处理后上清-80℃下至少稳定30d。同时未处理的含肌苷的新鲜血浆室温放置一段时间（3d）后肌苷完全降解，可以用来作为空白血浆配制标准曲线，不干扰肌苷和内标阿德福韦的定量分析。
3.3 4例受试者的血药浓度-时间曲线见图2。由图可见，4名受试者的药-时曲线均呈现不规律的多峰现象，推测其原因可能是多方面的。肌苷为机体内源性物质，内源性肌苷的干扰无法避免；在人体内，肌苷的变化途径复杂，作为嘌呤代谢过程中一个中间代谢产物，可以由腺苷、次黄嘌呤核苷酸和次黄嘌呤生成肌苷，同时肌苷也能通过不同途径代谢成次黄嘌呤或次黄嘌呤核苷酸，十几种酶参与其中，如肌苷酶、核苷磷酸化酶等。很多情况下，机体会针对某种内源性物质的增多或减少发生代偿反应，肌苷在人体内是否存在这种代偿性的保护机制目前尚不明确；另外，有些内源性物质受饮食、昼夜节律或生理周期影响明显，肌苷是否受饮食、昼夜节律或生理周期的影响还需进一步考察。
本研究建立LC-MS／MS测定人血浆中肌苷浓度的方法并进行了方法确证。该方法专属性强，样品处理方便，灵敏度高，适用于肌苷临床药动学研究。
［1］Ghram A，Reddy PG，Blecha F，et al.Effects of bovine respiratory disease viruses and isoprinosine on bovine leukocyte function in vitro［J］.Vet Microbiol，1989，20（4）：307-314.
［2］Pedersen BK，Tvede N，Diamant M，et al.Effects of isoprinosine treatment of HIV-positive patients on blood mononuclear cell subsets，NK-and T-cell function，tumour necrosis factor，and interleukins 1，2，and 6［J］.Scand J Immunol，1990，32（6）：641-649.
［3］Singh H，Herndon DN.Effect of isoprinosine on lymphocyte proliferation and natural killer cell activity following thermal injury［J］.Immunopharmacol Immunotoxicol，1989，11（4）：631-644.
［4］inosiplex GC，intraventricular interferon-alpha in subacute sclerosing panencephalitis（SSPE）：international multicenter study［J］.J Child Neurol，2003，18（12）：819-827.
［5］Tay SK.Efficacy of inosine pranobex oral therapy in subclinical human papillomavirus infection of the vulva：a randomized double-blinded placebo controlled study［J］.Int J STD AIDS，1996，7（4）：276-280.
［6］Georgala S，Katoulis AC，Befon A，et al.Oral inosiplex in the treatment of cervical condylomata acuminata：a randomised placebo-controlled trial［J］.BJOG，2006，113（9）：1088-1091.
［7］De Simone C，Famularo G，Tzantzoglou S，et al.Inosine pranobex in the treatment of HIV infection：a review［J］.Int J Immunopharmacol，1991，13Suppl 1：19-27.
［8］Brzeski M，Madhok R，Hunter JA，et al.Randomised，double blind，placebo controlled trial of inosine pranobex in rheumatoid arthritis［J］.Ann Rheum Dis，1990，49（5）：293-295.
［9］Georgala S，Katoulis AC，Befon A，et al.Inosiplex for treatment of alopecia areata：a randomized placebo-controlled study［J］.Acta Derm Venereol，2006，86（5）：422-424.
［10］US Food and Drug Administration.Guidance for Industry：Bioanalytical Method Validation［S／OL］.http：／／www.fda.gov／downloads／Drugs／GuidanceCompilance-RegulatoryInformation／Guidances／ucm070107.pdf.
［11］钟大放.以加权最小二乘法建立生物分析标准曲线的若干问题［J］.药物分析杂志，1996，16（5）：343-346.
［12］Jeng LB，Lo WY，Hsu WY，et al.Analysis of urinary nucleosides as helper tumor markers in hepatocellular carcinoma diagnosis［J］.Rapid Commun Mass Spectrom，2009，23（11）：1543-1549.
［13］Mei DA，Gross GJ，Nithipatikom K.Simultaneous determination of adenosine，inosine，hypoxanthine，xanthine，and uric acid in microdialysis samples using microbore column high-performance liquid chromatography with a diode array detector［J］.Anal Biochem，1996，238（1）：34-39.
［14］Farthing D，Sica D，Gehr T，et al.An HPLC method for determination of inosine and hypoxanthine in human plasma from healthy volunteers and patients presenting with potential acute cardiac ischemia［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2007，854（1／2）：158-164.
［15］Farthing D，Xi L，Gehr L，et al.High-performance liquid chromatography（HPLC）determination of inosine，apotential biomarker for initial cardiac ischaemia，using isolated mouse hearts［J］.Biomarkers，2006，11（5）：449-459.
