微小RNA鼻咽癌潜在的诊断标志和治疗靶点

龙表利综述，胡国华审校

（1．重庆市大足区人民医院耳鼻喉科 402360；2．重庆医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科 400016）

鼻咽癌主要为非角化鳞状细胞癌，其恶性程度很高，伴随着局部浸润和早期远处转移。鼻咽癌的病因主要包括3个方面，即遗传易感性、环境因素和EB病毒（EBV）感染，然而，鼻咽癌发病的分子机制仍未完全明确。鼻咽癌对放化疗非常敏感，如果肿瘤仅局限于鼻咽部，可以通过放疗治愈。遗憾的是，30%～40%确诊的患者已经到了晚期，他们往往在治疗4年后出现远处转移或局部复发。因此，迫切需要更深入地研究鼻咽癌的分子机制，寻找早期诊断和预后的生物标志物及开发新的治疗方案。

从体液中检测生物学标志物的方法叫做“体液活检”。最近，这种方法被高度重视，因为细胞内自由核酸类物质DNA、mRNA和微小RNA（mi RNA）作为血液中生物学标志物具有潜在的价值。这些天然的内源性小RNA分子可以下调或抑制mRNA的表达，在很多生物学进程中发挥重要的作用，如肿瘤的发生、发展。他们可能不仅是潜在的生物标志物，还是克服耐药性和肿瘤复发的药物靶点。本文主要从mi RNA与鼻咽癌、mi RNA作为诊断和预后的生物学标志物及mi RNA作为鼻咽癌的治疗靶点3个方面进行了综述。

1 mi RNA与鼻咽癌

1．1 mi RNA mi RNA是一类内源性非编码RNA分子，长度为22个核苷酸，新近发现在所有真核生物中起转录后调控作用。早在1993年，mi RNA在新杆状线虫lin-4类中首次被发现［1］。Lin-4编码小RNA，通过反义RNA之间相互作用调节lin-14翻译。最初，人们认为lin-4仅在蛔虫中存在，并没有得到广泛的关注。直到2001年，3个研究团队同时报道了他们关于mi RNA作为基因沉默调节器的研究［2-4］。之后，这些mi RNA受到极大的关注。目前，在所有多细胞真核生物、一些单细胞真核生物甚至一些非细胞生物（如病毒）中都已明确有mi RNA的存在。研究发现mi RNA在高等生物中是RNA调节器中最重要的一类。基于生物信息学分析，在多细胞真核生物中，mi RNA调节超过60%的基因。

一个成熟的mi RNA作为反式作用因子调节大多数基因，彻底改变了人们对基因调控网络的看法。据统计，大约50%mi RNA定位在易碎的染色体区，在肿瘤发生、发展中，这些染色体区域可能会出现DNA扩增、缺失和易位。另一个重大的发现是在2004年成功鉴定病毒编码的mi RNA（病毒mi RNA，v mi RNA）［5］。肿瘤相关v mi RNA在肿瘤发生、发展中起了重要作用。

1．2 mi RNA在鼻咽癌中的机制 众所周知，鼻咽癌的发病机制是一个非常复杂的过程，有许多重要的分子和相应的信号通路参与。研究证实EBV潜伏膜蛋白、Wnt／β-catenin通路的分子、生长因子和细胞外基质参与调节MAPK／ERK信号通路，在鼻咽癌发生、细胞增殖和转移的所有步骤中mi RNA起了一个关键的作用。许多科学家致力于发现mi RNA在鼻咽癌发展中的功能。Mi R-200a靶基因ZEB2和β-catenin不仅抑制鼻咽癌细胞的生长、迁移和侵袭，而且有助于上皮细胞间质向干细胞的过度，这是致癌作用的关键步骤［6］。c-Myc是细胞癌变的关键因子，研究表明c-Myc调节一系列mi RNA且被mi RNA调 节，如mi R-34b、-34c、-18a、-29a／b、-100、-141、-221和let-7家族成员。mi RNA功能失调导致一些其他重要分子的异常，如EZH2，一个多硫蛋白基因产物，调节组蛋白3的甲基化［7-8］；Plk1，调节G2／M期过渡的激酶；ROBO1，血管生成受体和调节子；Cox-2，前列腺素合成的限速酶。所有这些蛋白质在发病机理、转移和预后差等方面起了重要作用。两大实验室同时证明了mi RNA（mi R-26a，-98、-101）失调导致EZH2致癌基因过表达、细胞增殖、肿瘤形成和抑制细胞分化。在鼻咽癌中，降低mi R-26a表达能够激活c-myc、细胞周期蛋白D3和E2、细胞周期依赖激酶CDK4和CDK6，抑制CDK抑制剂p14、ARF、p21、CIP1的表达［7-8］。mi R-100下调导致Plk1过表达。通过mi RNA使Plk1表达沉默导致细胞有丝分裂显着增强［9］。抑制mi R-26b导致COX-2蛋白在去铁敏（解毒药，DFOM）处理的鼻咽癌细胞中表达上调。Mi R-10b在EBV阳性的C666-1／L MP鼻咽癌细胞中上调。相反的，在L MP1阴性的C666-1细胞过表达mi R-10使鼻咽癌细胞侵袭性增强并导致荷瘤裸鼠死亡。下调mi R-218，导致SLIT表观遗传学沉默，细胞凋亡蛋白BIRC5在鼻咽癌细胞中过表达。Mi R-28通过下调SLIT2-ROBO1通路抑制鼻咽癌进展。

2 mi RNA作为诊断和预后的标志物

2．1 EBV编码的v mi RNA EBV基因组总共有25个EBV mi RNA前体和44个成熟v mi RNA，对应BHRF1区（4个mi RNA）和BART区（40个mi RNA）。研究表明在鼻咽癌中BHRF1区无mi RNA表达，然而，BART mi RNA调节病毒和宿主靶点使其潜伏感染更容易，同时诱发致癌信号。

至今，在鼻咽癌中只有少数EBV mi RNA功能和作用靶点已经明确。据文献报道，已有3个EBV mi RNA，（mi RBART1-5p、mi R-BART16和mi RBART17-5p）引起EBV蛋白L MP1下调［10］。L MP1调节核转录因子-κB（NF-κB）信号从而控制宿主细胞的生长和凋亡，通过mi R-BART5下调宿主细胞基因PUMA抑制病毒感染的宿主细胞凋亡［11］。Mi R-BART2靶向作用于EBV DNA聚合酶BALF5，可能在细胞溶解到潜伏感染的过渡期通过延缓病毒的复制促进病毒进入潜伏期［12］。通过mi R-BART2使L MP2 A表达下调，有可能允许EBV感染的鼻咽癌细胞逃离宿主的免疫监督［13］。mi RBHRF1-3抑制干扰素诱导CXCL11，可阻断EBV从T细胞感染B细胞。然而下调应急诱导的自然杀伤（NK）细胞如MICB，mi R-BART2-5p导致病毒从识别和消除的NK细胞中逃逸［14-15］。Wong等［16］报道，通过mi RNA调节宿主与病毒相互作用机制，揭示mi RNA涉及到鼻咽癌的发病机制，而且对临床运用“体液活检”筛选生物学标志物具有巨大潜力，因为宿主血清v mi RNA与EBV v mi RNA有明确的相关性。EBV编码的mi RNA见表1。

表1 鼻咽癌中EBV编码的mi RNA

2．2 人类宿主编码的mi RNA 实时调查原始致癌EBV和宿主细胞相互作用并揭示病毒与细胞的监管动态比较困难。然而，仍然可以在临床样本中检测到mi RNA，在体内外试验中研究他们的功能。

最近，人们尝试各种各样的方法在临床鼻咽癌标本中发现人类mi RNA及与TNM分期的联系。2008年，Sengupta等［17］运用激光显微切割成对的鼻咽癌组织（肿瘤组织和癌旁组织）揭示了mi RNA表达谱。他们发现8个（共207）mi RNA较明显的表达改变，进一步研究mi R-29c的功能显示这个宿主mi RNA（h mi RNA）通过细胞外基质蛋白参与了鼻咽癌细胞的侵袭和转移。后来，用PCR mi RNo mes研究，鼻咽癌细胞中35个（共270）h mi RNA有显着的改变［18］。最近，34个h mi RNA的表达改变通过组织芯片研究，且与鼻咽癌临床分期相关。引人注目的是，神经系统和感官知觉的发育与鼻咽癌相关［19］。从5对鼻咽癌组织和癌旁组织mi RNo mes中，Wong等［16］利用一个大规模的阵列（包含850个宿主mi RNA和39个EBV病毒mi RNA）研究宿主病毒相互作用。

2．3 细胞自由mi RNA 除了大多数人们关注的细胞内mi RNA，最近在EBV阳性的细胞外基质中发现一些mi RNA。这些循环mi RNA能够进一步参与和抑制周围细胞和临近受体细胞的功能［20］。Rechavi等［21］报道称，当EBV编码的mi RNA与B细胞共培养，B细胞向非EBV感染的T细胞转化。更重要的是，他们发现mi RNA在受体T细胞中使目标基因表达沉默。另外一个研究显示在多个鼻咽癌细胞中（如C15、C17和C666-1），BART mi RNA-1（mi R-1-5p和5）和BART mi RNA-2（mi R-7-3p、12和13）被释放到细胞外基质中；此外，BART mi RNA在鼻咽癌裸鼠和鼻咽癌患者血清中均能检测到［22］。Meckes等［23］不仅检测到鼻咽癌细胞分泌BART-mi RNA，而且鉴定了病毒肿瘤蛋白L MP1作为分泌BART-mi RNA的信使。在这项研究中，进一步评估L MP1在调节外分泌体（如BART-mi RNA）中的作用，L MP1增加表皮生长因子受体的释放，导致细胞外调节蛋白激酶（ERK）和PI3 K／Akt信号通路的活化。近日，在血清中检测到EBV编码的cf mi RNA［16］。研究人员首次运用微阵列技术分析5对鼻咽癌组织芯片v mi RNA的表达差异，用实时定量PCR技术证实了表达上调的v mi RNA有12个（BART1-3p、2-5p、5、6-5p、6-3p、7、8、9、14、17-5p、18-5p、19-3p）。他们发现鼻咽癌患者血清中的v mi RNA与鼻咽癌细胞中的v mi RNA在数量上有明确的相关性。从生物信息学角度进一步分析结果提示BART v mi RNA是许多信号通路的靶分子。显然，v mi RNA参与PTEN（PI3 K／AKT通路）和Wnt信号通路（表1），包括抑癌基因如WIF1、NKD、CXXC4和APC（关键的Wnt抑制分子）和一些其他的信号分子如Wnt级联信号（ERK信号的NLK和调节泛素水解的BTRCP）相互调节［16］。

3 mi RNA基因治疗

携带mi RNA的慢病毒可用于鼻咽癌的基因治疗。2009年，Li等［24］用慢病毒表达mi R-155使环氧合酶-2（cox-2）在鼻咽癌细胞C666-1中表达沉默。他们研究表明Lenti-mi R-155可能会是一个更好的cox-2抑制剂。Qu等［25］通过研究mi R-155导致无线电电阻锰超氧化物歧化酶（SOD2）的沉默是否减少鼻咽癌抗电离辐射，结果表明mi R-155在CNE1细胞过表达，65%SOD2 mRNA和80%蛋白质下调，克隆形成减少（从24．5%减少到9．67%），提示mi R-155可能会提高鼻咽癌放疗效率。而Lenti-mi R-26a显着抑制鼻咽癌细胞在裸鼠体内成瘤能力，提示了一个潜在的治疗价值［7］。

4 结论与展望

mi RNA在鼻咽癌中各种生物功能的研究为人们提供了很有价值的信息，揭露了EBV相关性鼻咽癌发生的潜在机制。EBV利用他的v mi RNA通过推迟复制周期使其更容易在体内潜伏（如通过BART 2-5p失去对BALF5的调节功能）和逃避NK细胞（如MICB）。一旦EBV成功定居于易感的上皮细胞，病毒侵袭性感染逐渐变得活跃起来，渐渐开始有选择性地表达其癌基因和几个致癌mi RNAs，如L MP1／2和BART mi RNA在几个通路中关键调节分子信号转换过程中相互交流如βcatenin、NF-κB、ERK、c-myc。致癌作用经过多步骤积累，鼻咽上皮细胞逐渐发展为一个肿瘤微环境，伴随异常基因表达，增殖不受控制（如Pl K1、cyclin D和E）和抗细胞凋亡（如PUMA）。EBV甚至可以释放致癌物质，这些物质携带超负荷的病毒和细胞产物（如L MP1、v mi RNA和EGFR）到体液中形成一个易于肿瘤转移和侵袭的环境（如MMPs、Cox-2、ROBO1和ECM）。

通过micro RNA增进宿主与病毒之间相互交流作用，如h mi RNA和v mi RNA，为鼻咽癌肿瘤形成提供可能的潜在机制。hmi RNA和v mi RNA的大量研究，不仅可以作为潜在的生物学标志物用于筛查高危人群，而且可以成为鼻咽癌治疗靶点，增加鼻咽癌放化疗敏感性，降低复发和耐药性。

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