黄 欣，胡 英△，王秀娟，金丽艳，张双元
（1.青海大学医学院实验诊断教研室，西宁 810001；2.青海大学附属医院乳甲外科，西宁 810001）
Fas基因属于肿瘤坏死因子受体超家族成员［1］，是调控细胞凋亡的重要因子之一，与肿瘤的发生、发展关系密切［2］。Fas基因启动子区670位点位于核转录元件GAS的结合位点（ATTCCAGAAA）［3］，在该位点发生 GA→GG的替换，可破坏转录因子STAT1的结合位点，影响Fas基因的表达，从而使死亡信号转导通路失调而致细胞癌变［4］。在全球范围内乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一［5－6］。本研究探讨凋亡基因Fas－670的基因多态性与乳腺癌临床病理指标的关系，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集2010年1月至2012年11月青海大学附属医院收治的330例女性乳腺癌（均经组织病理学确诊）患者术前外周血5mL。患者术前均未经化、放疗。由于考虑到基因可能具有种族差异性剔除了非汉族患者资料，并剔除病理资料不全的患者资料后实际纳入研究232例。患者年龄26～83岁，中位年龄47岁。TNM分期Ⅰ期14例，Ⅱ期128例，Ⅲ期62例，Ⅳ期9例，分期不明19例。
1.2 方法 采集乳腺癌患者术前肘静脉抗凝血标本（EDTANa2抗凝）5mL，用血液基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技北京有限公司）提取外周血DNA，用聚合酶链反应－限制性片段长度多态性（PCR－RFLP）方法检测Fas－670（rs1800682）基因型。引物序列参照文献［6］由上海捷瑞生物工程有限公司合成。上游引物5′－ATA GCT GGG GCT ATG CGA TT－3′，下游引物5′－CAT TTG ACT GGG CTG TCC AT－3′。PCR反应体系25μL，含100ng模板DNA，10μmol／L上、下游引物各1 μL，12.5μL 2×Taq PCR Master Mix（天根生化科技北京有限公司），加ddH2O至25μL。反应条件：95℃预变性3min，94℃变性30s，退火温度为57℃，72℃延伸30s，共30个循环后，72℃最终延伸10min。PCR产物片段大小为193bp；20 μL PCR产物用限制性核酸内切酶ScrFⅠ（纽英伦生物技术北京有限公司）于37℃孵育2h以上，酶切产物于2.5%琼脂糖凝胶（溴化乙锭染色）电泳（70V，60min），利用凝胶成像系统观察基因型。
1.3 统计学处理 应用SPSS13.0软件进行统计学处理。以χ2检验分析Fas－670与青海地区乳腺癌临床指标的关系。检验方法均为双侧检验，检验水准α＝0.05。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 基因型分析 Fas－670纯合野生型AA产生1个193bp片段，纯合突变型GG有1个ScrFⅠ酶切位点，产生136bp和57bp两个片段，杂合型AG产生193、136和57bp 3个片段。见图1。
图1 PCR－RFLP检测FAS－670基因多态性
2.2 基因型分布 232例乳腺癌中，Fas－670基因多态频率分布：纯合野生型AA为39.7%（92／232）、杂合型AG为48.7%（113／232）、纯合突变型 GG 为11.6%（27／232）。其 Fas－670基因多态分布的频率分布符合群体遗传学Hardy－Weinberg平衡定律（χ2＝0.757，P＝0.384）。
2.3 Fas－670基因型与青海乳腺癌临床指标的关系 见表1。
表1 Fas－670基因型与青海地区乳腺癌临床指标的关系［n（%）］
3 讨 论
细胞增殖与细胞凋亡之间的不平衡是肿瘤形成的基础，Fas基因是调控细胞凋亡的重要因子之一。FasL与细胞表面的Fas结合，即可诱导靶细胞凋亡，而Fas／FasL介导的肿瘤细胞免疫逃逸机制有：（1）肿瘤细胞表达FasL，促进Fas高表达激活的T细胞凋亡，使肿瘤细胞产生免疫逃逸［7］，现已发现在乳腺癌、肺癌、肝癌、胃肠道肿瘤等多种肿瘤细胞高表达FasL。在机体抗肿瘤免疫应答时，活化的肿瘤特异性T细胞Fas表达增多［8］。（2）肿瘤细胞表面Fas表达缺失或下降，使肿瘤细胞凋亡受阻［9］，有研究表明乳腺癌Fas表达丢失和FasL过表达不仅参与了肿瘤的免疫逃逸和免疫耐受，还与肿瘤的浸润密切相关［10］。（3）凋亡抑制基因（如Bcl－2等）出现高表达［11］。
Fas基因启动区存在的Fas－670多态位点由于影响Fas基因表达，在肿瘤的发生、发展中显得尤为重要。本研究主要探讨凋亡基因Fas－670基因多态性与青海地区乳腺癌临床病理指标的关系。
国内张柏林等［12］对840例乳腺癌患者和840例健康人进行病例对照研究 Fas（－1377G／A 和－670A／G）和 FasL基因（－844T／C和7896G／C）基因多态性对乳腺癌发病风险的影响，结果发现：携带Fas－1377A／－670A单体型者乳腺癌的发病风险高 于 携 带 Fas－1377G／－670A 单 体 型 者，但 是 携 带 Fas－1377G／－670G单体型者乳腺癌的发病风险则低于Fas－1377G／－670A单体型携带者，提示Fas－FasL系统的功能性遗传多态性可能与乳腺癌的发病风险增加有关。Hashemi等［13］对伊朗134例乳腺癌患者和152例健康女性进行Fas－1377G／A（rs2234767）和－670A／G（rs1800682）基因多态性和乳腺癌的联系的研究，发现Fas－1377G／A（rs2234767）基因多态分布在这两组间并无显着不同，而Fas－670A／G（rs1800682）基因多态性与乳腺癌的风险有显着联系（P＝0.019）。
由于Fas基因多态性与肿瘤发病风险的关系存有争议，Zhang等［14］以34个已发表的病例对照研究为基础，对11 461例癌症患者和12 708例健康对照组用Meta法分析Fas两个基因多态性与肿瘤发病风险的关系，结果显示：Fas－1377AA基因型比－1377GG或GA／GG基因型有较高的肿瘤发病风险，而Fas－670GG基因型无影响。Knechtel等［15］对216例淋巴结阳性的乳腺癌妇女检测包括Fas－1377和Fas－670的16例基因多态性的影响，单因素分析发现Fas－1377基因多态性与无病生存率和总生存率显着相关，而Fas－670基因多态却与无病生存率和总生存率无关联。Crew等［16］在美国纽约研究1 053例乳癌患者和1 102例健康人Fas和FasL基因多态性与乳腺癌风险的关系发现，Fas－1377G／A、Fas－670G／A和 FasL－844C／T基因多态性与乳腺癌发病风险无显着联系，也没有数据显示基因多态性与年龄和雌激素水平等相关。本研究结果也未发现Fas－670基因多态性与青海地区女性乳腺癌患者的临床分期及肿瘤大小等临床病理指标有联系。
［1］Behrmann I，Walczak H，Krammer PH.Structure of the human APO－1gene［J］.Eur J Immunol，1994，24（12）：3057－3062.
［2］Muschen M，Warskulat U，Beckmann MW.Defining CD95 as a tumor suppressor gene［J］.J Mol Med，2000，78（6）：312－325.
［3］Huang QR，Morris D，Manolios N.Identification and characterization of polymorphisms in the promoter region of the human Apo－1／Fas（CD95）gene［J］.Molecul Immunol，1997，34（8／9）：577－582.
［4］Kanemitsu S，Ihara K，Saifddin A，et al.A functional polymorphism in Fas（CD95／Apo－1）gene promoter associated with systemic lupus erythematosus［J］.J Rheumatol，2002，29（6）：1183－1188.
［5］Parkin DM，Bray F，Ferlay J，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2005，55（2）：74－108.
［6］Sun T，Miao XP，Zhang XM，et al.Polymorphisms of death pathway genes Fas and FasL in esophageal squamous－cell carcinoma［J］.J Nati Cancer Inst，2004，96（13）：1030－1036.
［7］Li SY，Yu B，An P，et al.Influence of FasL gene expression on hepatic metastasis of colorectal carcinoma［J］.Hepat Pancreat Dis Int，2004，3（2）：226－229.
［8］Nomori H，Watanabe S，NaKajima T，et al.Histiocytes in nasopharyngeal carcinoma in relation to prognosis［J］.Cancer，1986，57（1）：100－105.
［9］Debatin KM，Krammer PH.Death receptors in chemotherapy and Cancer［J］.Oncogene，2004，23（16）：2950－2966.
［10］Ferreira LD，Pulawa LK，Jensen DR，et al.Overexpressing human lipoprotein lipase in mouse skeletal muscle is associated with insulin resistance［J］.Diabetes，2001，50（5）：1064－1068.
［11］Chang YC，Xu YH.Expression of Bcl－2in habited Fasmediated apoptosis in human hepatocellular carcinoma BEL－7404cells［J］.Cell Res，2000，10（3）：233－242.
［12］张柏林，孙瞳，刘海洁，等.Fas和FasL基因多态性增加乳腺癌发病风险［J］.中国医药导刊，2009，11（12）：2096－2098.
［13］Hashemi M，Fazaeli A，Ghavami S，et al.Functional polymorphisms of Fas and FasL gene and risk of breast cancer－pilot study of 134cases［J］.PLoS One，2013，8（1）：e53075.
［14］Zhang ZZ，Xue HC，Gong WD，et al.Fas promoter polymorphisms and cancer risk：a meta－analysis based on 34 case－control studies［J］.Carcinogenesis，2009，30（3）：487－493.
［15］Knechtel G，Hofmann G，Gerger A，et al.Analysis of common germline polymorphisms as prognostic factors in patients with lymph node－positive breast cancer［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2010，136（12）：1813－1819.
［16］Crew KD，Gammon MD，Terry MB，et al.Genetic polymorphisms in the apoptosis－associated genes Fas and FasL and breast cancer risk［J］.Carcinogenesis，2007，28（12）：2548－2551.
