阳 琰，高 琳△，邓华聪，晏永慧，李显文，王小英，廖 鑫，张 晗，陈其荣，王 茜
（1.遵义医学院附属医院内分泌科563003；2.重庆医科大学附属第一医院400016）
高三酰甘油（hypertriglyceridemia，HTG）血症在胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）相关性疾病如肥胖、2 型糖尿病（T2DM）、冠心病等的发展中起重要作用［1］。HTG血症与T 2DM发病率增多有关。HTG 血症是T2DM发生的独立危险因素，以HTG为标志的脂代谢异常常伴IR，其可能发生在糖代谢紊乱之前［2］。因此，HTG血症的危害已经引起内分泌学者的高度重视。灯盏花素（breviscapine）是从菊科短亭飞蓬属植物中提取出来的黄酮类有效成分，是灯盏乙素和少量甲素的混合物，其中灯盏乙素含量占95%以上，灯盏花素药理活性广泛，具有抗血小板、抗血栓等作用，被广泛应用于临床治疗，并具有降低TG的作用［3］，但其具体作用机制不清楚。目前发现TG与肝脏过氧化物酶体增殖物激活受体-α（peroxisome proliferator-activated receptor-alpha，PPAR-α）、载脂蛋白A5（apolipoprotein A5，apo A5）基因表达密切相关［4］，但灯盏花素降低TG是否也与PPAR-α、apo A5 基因表达有关，目前国内外未见相关研究报道。因此，本研究拟通过观察灯盏花素在不同时间点对HepG2 肝细胞内PPAR-α、apo A5 表达及三酰甘油含量的影响，旨在初步探讨灯盏花素降低三酰甘油的可能机制，为进一步探索灯盏花素调节TG 代谢的具体机制奠定一定的基础。
1 材料与方法
1.1 主要试剂HepG2 细胞购于协和医院细胞库。灯盏花素注射液购于昆明龙津药业股份有限公司。DMEM购于Gibco-BRL 公司，胎牛血清购于杭州四季青公司。实时荧光定量PCR试剂 盒 购 于Takara公 司。apoA5抗 体（ab36974）购 于Santa Cruz 公司。二抗和细胞蛋白抽提试剂盒均购于宝生物公司。三酰甘油测定试剂盒购于北化康泰临床试剂公司。
1.2 细胞培养与分组Hep G2 细胞被培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，0.25%胰酶进行消化，每2～3 天更换1 次培养基并进行传代。HepG2 肝细胞接种于6 孔板中，12h 后长至融合度为80%左右，更换为无血清的DMEM培养基，在浓度依赖实验的基础上，选取100 mmol／L 灯盏花素进行时间依赖实验。加入100 mmol／L 灯盏花素，不同干预时间点（0、6、12、24、36、48 h），分别定义为：（1）0 h 组（空白对照）；（2）6h 组；（3）12h 组；（4）24 h 组；（5）36h 组；（6）48h 组；每组取3 个复孔，所测结果取3 孔平均值。
1.3 测定各组细胞apo A5 基因及TG含量PPAR-α引物正义：5′-ACT TAT CCT GTG GTC CCC GG-3′；反义：5′-CCG ACA GAA AGG CAC TTG-3′；apo A5引 物 正 义：5′-ACG CAC GCA TCC AGC AGA-3′；反 义：5′-TGA AAG ATT CGG AAA C-3′；GAPDH引物正义：5′-TAG TTG CGT TAC ACC CTT TCT-3′；反义：5′-TGC TGT CAC CTT CAC CG-3′。提取细胞总RNA，以总RNA 1.5μg 为逆转录反应模板，进行逆转录总的反应体积是20μL。反应体系总体积为25 μL，sterile water 16.3μL，10 ×Taq buffer 2.5μL，引物1（10 μM）0.75μL，引物2（10μM）0.75μL，MgCl2（25 m M）1.5 μL，4d NTP（2.5 m M）2μL，cDNA 1μL，Taq酶5 U （0.2 μL）。条件：94℃5 min，94℃30 s，退火温度30 s，72℃延长20 s，循环34 次，72 ℃延长10 min。按照TG试剂盒说明书进行操作（酶法测定）。
1.4 测定各组细胞apo A5 蛋白表达 收集经上述处理后的细胞，用BCA法定量测定各组细胞apo A5 蛋白表达水平。取30μL 蛋白质加样，经12%PAGE电泳后转移到PVDF 膜上，取apo A5一抗的稀释度为1∶2000，二抗的稀释度为1∶1000，碱性磷酸酶法显色，曝光。
1.5 统计学处理 应用SPSS16.0统计软件包进行统计分析，计量资料采用±s表示，正态分布资料应用随机区组设计资料的方差分析及其两两比较，分析各组细胞内apo A5 基因、蛋白表达及TG含量的差异。P＜0.05 为差异有统计学意义。
2 结 果
在0～24 h之 内，HepG2肝 细 胞 内PPAR-α、apoA5基 因及蛋白表达水平随着灯盏花素作用时间增加而增加，当达到36 h 后HepG2 肝细胞内PPAR-α、apoA5 基因及蛋白表达水平开始下降，48 h下降最明显，但均高于空白对照组（P＜0.05）；而肝细胞内三酰甘油含量在0～24 h 之内随着灯盏花素作用时间增加反而降低，至24 h时降到最低（P＜0.05），36 h 后又开始升高，48 h升高最明显，但均低于空白对照组（P＜0.05），见表1、2，图1、2。
图1 灯盏花素在不同时间点对Hep G2 肝细胞PPAR-α蛋白表达的影响
表1 灯盏花素在不同时间点对HepG2肝细胞PPAR-α、apo A5 mRNA表达及TG的影响（±s）
表1 灯盏花素在不同时间点对HepG2肝细胞PPAR-α、apo A5 mRNA表达及TG的影响（±s）
时间（h） PPAR-α apoA5 TG（mg／g）0（空白对照）0.823±0.1130.0027±0.00031228.8±144.261.323±0.153＊＃ 0.0051±0.0008＊＃ 849.3±104.4＊＃123.132±0.421＊＃ 0.0069±0.0011＊＃ 628.2±85.1＊＃
续表1 灯盏花素在不同时间点对Hep G2肝细胞PPAR-α、apo A5 m RNA表 达 及TG的 影 响（±s）
续表1 灯盏花素在不同时间点对Hep G2肝细胞PPAR-α、apo A5 m RNA表 达 及TG的 影 响（±s）
时间（h） PPAR-α apoA5 TG（mg／g）244.357±0.075＊＃ 0.0121±0.0018＊＃ 422.2±67.2＊＃361.631±0.023＊＃ 0.0059±0.0010＊＃ 712.3±77.4＊＃481.172±0.014＊＃ 0.0042±0.0006＊＃ 952.3±94.1＊＃
图2 灯盏花素在不同时间点对Hep G2 肝细胞apo A5 蛋白表达的影响
3 讨 论
2011年欧洲心脏病学会（ESC）和欧洲动脉粥样硬化学会（EAS）联合发布的血脂异常管理指南明确指出，TG在脂毒性危害中占据非常重要的地位。肝脏是三酰甘油代谢的重要器官，高三酰甘油血症是糖尿病发生、发展的重要病理生理基础和特征［5］。肝脏中有许多调控三酰甘油代谢的基因表达，其中apo A5 基 因 与TG、IR、代 谢 综 合 征 密 切 相 关［6-7］，因 此，从apo A5 基因出发进行研究，可能对于阐明T2DM、HTG血症的发生、发展有非常重要的意义。
在临床治疗中，多数糖尿病患者均具有高TG血症，在进行降糖治疗过程中，应积极考虑降脂治疗，但传统降脂药物可能驱使血脂更集中于肝脏进行代谢，反而促使脂质贮积并损害肝功能［8］，尤其对于糖尿病合并脂肪肝的患者极为不利。近年研究表明灯盏花素的药理作用非常广泛，被广泛应用于临床治疗，其疗效肯定，除扩张微血管、降低血液黏稠度、改善微循环外，还具有降低血脂，尤其是TG，并对糖尿病性肝脏损害有一定的治疗和保护作用［9］，但其具体作用机制仍不清楚。因此，本研究通过观察灯盏花素在不同时间点对人HepG2细胞内TG含量的影响，旨在初步探讨灯盏花素降低肝脏内TG的机制，可能为防治糖尿病性脂肪肝提供一点新的思路和靶点。
本研究结果发现，在0～24 h 随着灯盏花素作用时间的增加，Hep G2 肝细胞内PPAR-α、apoA5 基因、蛋白表达水平也随之增加，当达到36 h 后又开始下降，48h 下降最明显，但均高于空白对照组（P＜0.05）；而肝细胞内TG含量在0～24 h 随着灯盏花素作用时间增加而降低，至24 h 时TG含量降到最低（P＜0.05），36 h 后又开始上升，48h 升高最明显，但均低于空白对照组（P＜0.05）。由此可推测，灯盏花素能降低肝脏TG含量，并具有时间依赖性，其机制可能是通过增加PPAR-α的表达，进而增加apo A5 表达从而使TG含量降低，但其具体机制有待进一步研究探索。
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